Functional characterization of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) dimerization

Abstract

Parkinson’s disease (PD), the second most common neurodegenerative disorder, afflicts 1 – 2% of people over age 50. During the last decade, several genes associated to familial forms of PD have been discovered and have led to a greatly improved understanding of the molecular pathways putatively involved in the pathogenesis of PD. Recently, mutations in the gene encoding leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) were revealed to be the most common genetic cause for late-onset PD. LRRK2 is a large multidomain protein kinase with a ROC-COR (ROCO) domain tandem archetypal for the ROCO protein family, providing a ROC domain capable of GTP binding and hydrolysis. Given the frequent dimerization of protein kinases, this study seeked to shed light on putative LRRK2 dimerization, meanwhile an emerging theme in the field. Employing different experimental assays, the ROCO domain was mapped as the core interface directing LRRK2 dimerization. Moreover, homodimerization potential mediated by the respective ROCO domain was similarly revealed for the related ROCO kinases LRRK1 and DAPK1 (death-associated protein kinase 1). Intriguingly, heterodimerization potential among ROCO domains discovered in this study suggested a regulatory interplay between all three mammalian ROCO kinases. Whereas familial PD mutations in the ROCOLRRK2 domain uniformly weakened ROCOLRRK2 homodimerization, regular self-interaction of GTP binding deficient ROCOLRRK2 mutants indicated independence from GTP. Most interestingly, challenging regular full length LRRK2 dimerization by co-expression of the ROCOLRRK2 fragment, a significant inhibitory effect on LRRK2 autophosphorylation was disclosed. Importantly, the pathological augmented kinase activity of G2019S PD mutant LRRK2 was decreased identically. Consistent with weakened homodimerization, ROCOLRRK2 fragments containing familial PD mutations accordingly showed a reduced LRRK2 kinase inhibiting effect. Taken together, these findings suggest a general dimerization function for the ROCO domain, a notion supported by recent identification of bacterial ROCO domain dimerization. By virtue of its kinase inhibiting effect, the artificial ROCO fragment could serve as a blueprint for LRRK2 dimerization/kinase inhibitors, ultimately providing new therapeutic perspectives in the treatment of PD.

Morbus Parkinson ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung und betrifft 1 – 2% der über 50-jährigen. Während der letzten zehn Jahre wurde die Assoziation von verschiedenen Genen mit familiären Formen von Parkinson entdeckt. Dies führte zu einem verbesserten Verständnis der molekularen Signalwege und Mechanismen, die der Erkrankung vermutlich zugrunde liegen. Vor kurzem wurden Mutationen im Gen für die Leucin-reiche Kinase 2 (leucine-rich repeat kinase 2; LRRK2) als häufigste genetische Ursache für Morbus Parkinson mit spätem Beginn identifiziert. LRRK2 ist eine große multi-Domänen Proteinkinase mit einem ROC-COR (ROCO) Domänentandem, das charakteristisch für die ROCO Proteinfamilie ist und eine ROC Domäne zur GTP-Bindung und -Hydrolyse enthält. Da Proteinkinasen häufig dimerisieren, sollte in dieser Studie eine mögliche Dimerisierung von LRRK2 untersucht werden. Mit Hilfe verschiedener experimenteller Ansätze konnte die ROCO Domäne als Hauptinteraktionsregion für die LRRK2 Dimerisierung identifiziert werden. Darüber hinaus wurde ROCO-vermitteltes Homodimerisierungspotential auch für die verwandten ROCO Kinasen LRRK1 und DAPK1 (death-associated protein kinase 1) gefunden. Das in dieser Studie ebenfalls entdeckte Heterodimerisierungspotential zwischen ROCO Domänen lässt eine regulatorische Wechselwirkung innerhalb der ROCO Kinasefamilie in Säugern vermuten. Während familiäre Parkinson-Mutationen in der ROCOLRRK2 Domäne einheitlich zu einer Abschwächung der ROCOLRRK2 Homodimerisierung führten, wies die reguläre Selbstinteraktion von GTP Bindungs-defizienten ROCOLRRK2 Mutanten auf eine GTP-Unabhängigkeit der Selbstinteraktion hin. Interessanterweise führte die Co-Expression von ROCOLRRK2 Fragmenten zu einer signifikanten Inhibition der LRRK2 Autophosphorylierung. Die pathologisch erhöhte Kinaseaktivität der G2019S Parkinson LRRK2 Mutante konnte durch die Co-Expression von ROCOLRRK2 Fragmenten gleichermaßen reduziert werden. Übereinstimmend mit ihrer schwächeren Homodimerisierung zeigten ROCOLRRK2 Fragmente mit familiären Parkinson-Mutationen bei Co-Expression einen reduzierten inhibitorischen Effekt auf die LRRK2 Autophosphorylierung. Zusammenfassend weisen diese Daten auf eine generelle Dimerisierungsfunktion für die ROCO Domäne hin. Diese Vermutung wird auch durch die kürzliche entdeckte Dimerisierung einer bakteriellen ROCO Domäne gestützt. Aufgrund seines Kinase-inhibierenden Effektes könnte das artifizielle ROCO Fragment als Vorlage für LRRK2 Kinase/Dimerisierungs-Inhibitoren dienen und somit eine Perspektive für neuartige Therapieansätze bei der Behandlung von Morbus Parkinson bieten.