Induktion der Apoptose in humanen Tumorzelllinien durch Inhibition der Phosphatidylinositol-3-Kinase

Abstract

Die Phosphatidylinositol-3-Kinase spielt eine essentielle Rolle in einer Vielzahl zellulärer Funktionen wie Proliferation, Migration, Angiogenese und Zelltod. Als ein wichtiger Regulator des Zellüberlebens stellt sie zudem einen direkten Gegenspieler der Apoptose dar. Wie kürzlich nachgewiesen werden konnte, findet sich eine konstitutive Aktivierung der PI(3)K in verschiedenen humanen Tumoren wie beispielsweise dem Prostata-, Ovarial- oder Bronchialkarzinom. Daher stellt die Inhibition dieses Signalweges eine viel versprechende Option für zukünftige Behandlungen maligner Erkrankungen dar. Das Nierenzellkarzinom (NZK) ist ein besonders therapieresistenter Tumor, an dem jährlich weltweit bis zu 100.000 Menschen sterben. Die Erstlinien-Standardtherapie dieses Malignoms erwies sich bisher als weitgehend erfolglos. Auch der Einsatz von Zytokinen wie IL-2 oder IFN-alpha brachte nur eine geringe objektive Ansprechrate von etwa 10-20%. Da eine erhöhte Aktivität des PI(3)K/AKT-Signalweges in einem Großteil der Nierenzellkarzinome beschrieben wird, sollten in dieser Arbeit die molekularen Folgen einer Hemmung der PI(3)-Kinase und die antineoplastische Effektivität von LY294002, einem spezifischen Inhibitor dieses Enzyms, bei Nierenzellkarzinomen untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Inkubation von NZK-Zellen mit LY29002 die Sekretion der Wachstums- und angiogenetischen Faktoren IL-6 und VEGF über eine Beeinflussung der Expression von RelB und HIF-1alpha inhibiert. Darüber hinaus wurde infolge der Stimulation der malignen Zellen mit LY294002 eine Induktion der Apoptose in allen verwendeten NZK-Zelllinien beobachtet. Um die molekularbiologischen Folgen einer Induktion des programmierten Zelltodes mit LY294002 zu analysieren, wurden Jurkat-Zellklone verwendet, die entweder defizient für wichtige Proteine im Rahmen der Weiterleitung des apoptotischen Signals waren oder Bcl-2, ein antiapoptotisch wirksames Molekül, überexprimierten. In den durchgeführten Experimenten konnte kein Effekt von LY294002 auf die Apoptose von Caspase-8- und FADD-defizienten Zellen im Vergleich zu ihren Vektor-Kontrollzellen nachgewiesen werden. Gegensätzlich hierzu waren Tumorzellen die Bcl-2 überexprimierten oder defizient für Caspase-9 waren, resistent gegenüber einer Apoptose-Induktion mittels PI(3)K-Inhibition. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Inhibition durch LY294002 zu einer mitochondrial-vermittelten, unabhängig des extrinsischen Singalweges erfolgenden Apoptose führt. Dem entspricht auch die Beobachtung, dass die Inkubation mit LY294002 zu einer konzentrationsabhängigen Spaltung von PARP, einem wichtigen DNA-Reperatur-Gen, in den FADD- und Caspase-8-defizienten, nicht aber in den Bcl-2-übexprimierenden oder Capase-9-defizienten Jurkatzellen, führte. Zudem konnte durch eine gemeinsame Verwendung von LY294002 und TRAIL bzw. Etoposid in der Behandlung von Jurkat-Zellen eine erhöhte Rate des apoptotischen Zelltodes erreicht werden. Erstaunlicherweise steigerte die gleichzeitige Stimulation der Zellen mit LY294002 und TRAIL die Apoptose auch in den ursprünglich LY294002-resistenten, Caspase-9-defizienten Jurkat-Zellen.

The phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway regulates many cellular processes that are involved in tumor progression. Aberrant activation of the PI3K pathway due to an alteration of its members like PTEN or Akt occurs quite frequently in malignant cells. Thus, inhibition of this pathway represents a promising option for the treatment of cancer patients. The best characterized PI3K inhibitors are LY294002 and wortmannin that were shown to disrupt downstream signaling and induce apoptotic cell death in tumor cells. In our study we analyzed the effect of PI3K inhibition in cell lines deduced from renal cell carcinomas (RCC), a treatment resistant tumor with constitutive activation of the PI3K pathway. Incubation of RCC cells with LY294002 inhibited the secretion of growth and angiogenic factors that was due to a reduced expression of nuclear localized transcription factors relB and HIF-1alpha. Furthermore, addition of this compound to the culture medium induced apoptosis in RCC cell lines. To delineate the pathway of apoptosis induction we took advantage of Jurkat cells overexpressing or lacking molecules involved in apoptotic pathways. We found that LY294002 had no effect on apoptotic cell death in cells deficient of FADD or caspase-8 as compared with wild type cells. In contrast cells overexpressing Bcl2 or lacking caspase-9 were resistant to apoptotic death indicating that PI3-kinase inhibition is independent of the external death receptor signaling and is mediated via the mitochondrial pathway. Interestingly, the addition of TRAIL increased the apoptotic effects of PI3K inhibition even in caspase-9 deficient cell.