Generierung nicht-alloreaktiver T-Zellen zur adoptiven Immuntherapie im klinischen Maßstab

Abstract

Die hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) mittels CD 34 positiven haploidentischen Stammzellen stellt seit mehr als einem Jahrzehnt eine etablierte Therapie maligner und nichtmaligner Erkrankungen immunologischer und hämatopoetischer Zellen dar. In jüngerer Zeit werden auch CD 3 depletierte Stammzellen appliziert. Ein Nachteil dieser Methode liegt in der Transplantatabstoßung und einer prolongierten Immundefizienz. Mittels geringer Mengen an Spenderlymphozyten als DLI wird versucht, einer aufkeimenden Transplantatabstoßung entgegenzuwirken, ohne eine GVHD entstehen zu lassen. Weitere schwerwiegende Komplikation stellen neben viralen Infektionen auch komplizierte Pilzinfektionen dar. Die Verabreichung von immunkompetenten, nicht alloreaktiven T-Zellen mit antipathogener Potenz und möglichem GVL-Effekt könnte eine Möglichkeit der Reduktion von Morbidität und Mortalität im Posttransplantationsstadium darstellen, ohne dabei eine erhöhte GVHD Rate zu provozieren. Um dieses Ziel zu erreichen, generierten wir mittels Aktivierungsantigenmarkierung und nachfolgender magnetischer Zellseparation T-Zellen im klinischen System, die in mindestens zwei verschiedenen Testmethoden nachweislich deutlich reduzierte allogene Eigenschaften besaßen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass diese T-Lymphozyten eine starke Aktivierungsfähigkeit gegenüber viralen Antigenen aufwiesen. Versuche mit entsprechenden Patientenzellen im klinischen System konnten diese viel versprechenden Ergebnisse nicht verifizieren. Unter Umständen liegt dies an der nicht ausreichenden Anzahl und Reinheit der zur Verfügung stehenden Patientenzellen. Das von uns durchgeführte T-Zelldepletionsverfahren könnte, unter der Voraussetzung des Einsatzes geeigneter APC, virale Infektionen vermeiden, ein Abstoßen verhindern sowie einem Rezidiv entgegenstehen und somit einen Fortschritt in der allogenen Transplantation darstellen. Der BrdU-Inkorporationsassay stellt eine alternative Methode zur näheren Charakterisierung von T-Lymphozytensubpoplationen dar. Simultane Untersuchungen hinsichtlich Proliferationsfähigkeit, Oberflächenantigenexpression und Zytokinexpression auf Einzelzellebene werden durch diesen Test ermöglicht. Wir konnten in dieser Arbeit die Gleichwertigkeit des BrdU-Inkorporationsassay zu allgemein anerkannten Testverfahren wie dem [H3] Proliferationstest und dem EliSPOT belegen. Ein Einsatz würde eine nähere Charakterisierung von aktivierten Lymphozytensubpopulationen auf Einzelzellebene im zeitlichen Verlauf ermöglichen.

Application of Hematopoeitic stem cell transplantation (HSCT) of purified CD 34+ stem cells represents a well established method for the treatment of a wide range of malignant and non malignant immunologic dieseases. To avoid GVHD in the recipient, CD 3+ T cells are depleted prior to transplantation with the main detriment of a) risk of graft rejection and b) prolonged immune deficiency combined with the risk of severe viral infection and mycosis. To establish non alloreactive T cells with preserved and persistent immunological, antiviral and antipathogenic potency without causing GVHD, we co-cultivated T cells with allogenic cells in a primary MLC. Afterwards, the T cells activation surface antigens were labeled and, via magnetic cell separation (CliniMACS®), effectively separated (99,42(+/-0,26)% purity) from the non reactive T cells. These non reactive cells (=non allogenic T cells) were further investigated. With a variety of different test methods we showed a decrease in alloreactivity in these cells to 5,31 percent (Flow cytometry). In the Elispot assay, the antiviral potency increased by 444 percent (versus Adeno Virus). Experiments with T cells from pediatric patients did not confirm our findings. To characterize T cells, we used the BrdU-Incorporation assay and compared it to the well established [H3] Thymidin Incorporation Assay. We proved the BrdU Assay to correlate with the Thymidin Incorporation Assay (p-Value: 1,0), which enables the user to further investigate immunologic cells on a single cell level.