Safety testing of indocyanine green and trypan blue on retinal pigment epithelium cells

Abstract

Background and aims: Indocyanine green (ICG) and Trypan blue (TB) are frequently used vital stains for ILM-staining during macular hole surgery. Lately, there are growing concerns in terms of safety to retinal tissues, especially to the retinal pigment epithelium (RPE). The aim of this experimental study was to examine potentially cytotoxic effects of ICG and TB on cultured human RPE cells.

Methods: ARPE-19 cells were incubated with ICG (0.025–5.0 mg/ml) and with ICG-free solutions of corresponding osmolarities. TB was applied at 0.0375 mg/ml and 1.5 mg/ml. Incubation lasted 1–20 minutes with or without vitrectomy endolight illumination for 1–5 minutes. To mimic clinical practice, exposure time was set at 1 minute, followed by 5 minutes of illumination. Cell viability and morphology were examined after the follow-up times of 6, 24 and 72 hours.

Results: ICG reduced cell viability at concentrations of 2.5 mg/ml and higher, when incubated for more than 5 minutes. Almost no cytotoxicity was observed for ICG at a concentration of 1.0 mg/ml and below, at any incubation time. Hypo-osmolar solutions below 270 mOsm/kg induced severe cytotoxicity independently of ICG, especially at exposure times of 10 minutes and more. At incubation times below 1 minute, osmolarity didn’t play a major role. Incubation with ICG for 1 minute, and illumination for 5 minutes, did not cause damage at concentrations of up to 1.0 mg/ml. TB-related cell toxicity occurred at 1.5 mg/ml for incubation times above 5 minutes. No phototoxic effects for TB solutions were shown in any set-up with vitrectomy endolight illumination.

Conclusions: For clinical use ICG concentration should not exceed 1.0 mg/ml, exposure and illumination time should remain below 5 minutes, the osmolarity being within physiological range. TB at short incubation times or low concentrations seems to be a safe alternative without phototoxicity.

Hintergrund und Ziele: Indozyaningrün (ICG) und Trypan blau (TB) sind häufig verwendete Farbstoffe zur Anfärbung der Membrana limitans interna in der Chirurgie der Makulaforamina. In letzter Zeit stieg jedoch die Zahl der Bedenken bezüglich schädlicher Wirkungen auf bestimmte Netzhautabschnitte, insbesondere auf das retinale Pigment Epithel (RPE). Das Ziel dieser experimentellen Arbeit war die systematische Untersuchung möglicher zytotoxischer Effekte von ICG und TB auf kultivierte humane RPE Zellen.

Methoden: Zellen der ARPE-19 Reihe wurden sowohl mit ICG (0.025–5.0 mg/ml) als auch mit ICG-freien Kontrollösungen mit jeweils ähnlichen Osmolaritäten inkubiert. TB wurde in Konzentrationen von 0.0375 mg/ml und 1.5 mg/ml verwendet. Die Dauer der Inkubationszeiten betrug 1–20 Minuten jeweils mit und ohne die begleitende Beleuchtung durch eine Kaltlichtquelle für 1-5 Minuten. Um die klinische Vorgehensweise zu simulieren, wurden zudem Experimente mit einer Inkubationszeit von 1 und einer Gesamtbeleuchtungszeit von 5 Minuten durchgeführt. Die Vitalität und die Morphologie der Zellen wurden jeweils nach 6, 24 und 72 Stunden begutachtet.

Ergebnisse: ICG-Konzentrationen ab 2.5 mg/ml führten bei Inkubationszeiten ab 5 Minuten zur Reduzierung der Anzahl vitaler Zellen. Bei der Verwendung von ICG Lösungen mit Konzentrationen bis zu 1.0 mg/ml wurden, unabhängig von der Inkubationsdauer, kaum zytotoxische Effekte beobachtet. Hypoosmolare Lösungen, mit Osmolaritäten unterhalb von 270 mOsm/kg, führten vor allem bei Inkubationszeiten ab 10 Minuten zu ausgeprägten Zellschäden unabhängig von der Verwendung von ICG. Bei Inkubationszeiten bis zu 1 Minute spielte die Osmolarität der Lösungen hingegen keine gewichtige Rolle. Die Inkubation der Zellen mit ICG für 1 Minute begleitet von einer Gesamtbeleuchtungszeit von 5 Minuten führte bei Konzentrationen bis zu 1.0 mg/ml nicht zur Zellschädigung. Zytotoxische Effekte von TB fanden sich bei einer Konzentration von 1.5 mg/ml und ab einer Inkubationszeit von 5 Minuten. Phototoxische Wirkungen von TB konnten in keinem der durchgeführten Set-ups beobachtet werden.

Schlußfolgerungen: Bei der Verwendung von ICG im klinischen Bereich sollte die Konzentration 1.0 mg/ml nicht übersteigen, die Expositions- und Beleuchtungszeiten sollten weniger als 5 Minuten betragen und die Osmolarität sollte sich im physiologischen Bereich befinden. Die Verwendung von TB in niedrigen Konzentrationen bei kurzen Inkubationszeiten erscheint als sichere Alternative ohne phototoxische Wirkung.