Untersuchung tumorassoziierter Immunprozesse nach Behandlung mit neuartigen Methoden bei Krebspatienten

Abstract

Das Forschungsfeld der Immuntherapien in der Behandlung von Tumorerkrankungen gewinnt immer mehr an Bedeutung. Vorliegende Arbeit hat zwei neuartige Therapiekonzepte untersucht. Zum einen wurde die Antwort antigenspezifischer zytotoxischer T-Zellen nach Vakzinierung mit Peptid-beladenen dendritischen Zellen bei Patienten mit fortgeschrittenem Nierenzellcarcinom untersucht. Zum anderen wurde die Immunantwort nach Radiofrequenzablation primärer und sekundärer Leber-, Lungen- und Nierentumoren bestimmt. Hierbei wurden ebenfalls die Aktivität von CD8+ T-Zellen, sowie die Serumkonzentrationen von Hitzeschockproteinen (HSP70, gp96) und Alarmsignalen des Immunsystems (Harnsäure) gemessen. Für in vitro-Experimente wurden aus peripherem Blut von Patienten mononukleäre Zellen (PBMCs) und Serum isoliert. Die Blutproben wurden jeweils zu definierten Zeitpunkten abgenommen. Die Serumkonzentrationen von HSP70 wurden mittels spezifischem ELISA gemessen. Die Bestimmung der Harnsäurespiegel geschah durch standardisierte Messmethoden des Zentrallabors am Universitätsklinikum Tübingen. Die PBMCs der Patienten wurden in vitro mit Peptiden stimuliert, die entweder auf MHC-Klasse-I-Molekülen der Tumorzellen des jeweiligen Carcinoms (Radiofrequenzablation) exprimiert werden oder im Impfcocktail den Patienten appliziert wurden. Spezifische IFN-Produktion wurde danach mittels RT-PCR, intrazellulärer IFN-Färbung und ELISPOT gemessen. Antigenspezifische T-Zellen konnten außerdem direkt mit spezifischen MHC-Klasse-I-Tetrameren nachgewiesen werden. Einer von 9 vakzinierten Patienten zeigte nach wiederholter Impfung eine Aktivitätsvermehrung antigenspezifischer T-Zellen. Bei 8 von 15 Patienten konnte nach Radiofrequenzablation eine erhöhte Aktivität antigenspezifischer T-Zellen gemessen werden. Keiner der untersuchten 51 Patienten hatte am Tag nach RF-Ablation einen angestiegenen Harnsäurewert. Gut die Hälfte von 24 Patienten zeigte am Tag nach RF-Ablation mindestens auf das Doppelte erhöhte HSP70-Serumkonzentrationen. In der Kontrollgruppe mit 20 Patienten war dieser Anstieg nach Leberbiopsie nicht zu beobachten. Vorliegende Ergebnisse dokumentieren die Induktion einer antigenspezifischen Immunantwort durch beide untersuchte Methoden. Die Vakzinierung mit Peptid-beladenen dendritischen Zellen kann nach vorliegenden Ergebnissen zu einer Aktivitätsvermehrung von T-Zellen führen. Radiofrequenzablation bewirkt die Ausschüttung von Alarmsignalen ins Serum, sowie eine antigenspezifische T-Zell-Antwort gegen tumorspezifische Antigene. Diese durch vorliegende Untersuchungen dokumentierte Induktion einer Immunantwort stellt somit einen positiven Effekt der RF-Ablation zusätzlich zur lokalen Therapie dar.

The development of immune activating therapies is an important field in cancer research. This thesis evaluated two new approaches. On the one hand, the response of antigen specific T cells after vaccination with peptide-pulsed dendritic cells was evaluated in patients with advanced renal cell carcinoma. Second, the activation of an antitumoral immune response induced by radiofrequency ablation of primary and secondary tumors in liver, kidney and lung cancer was detected. Hitherto, the activity of cytotoxic T cells and the expression of heat shock proteins (HSP70, gp96) and other alarm signals (uric acid) of the immune system was measured. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and serum were isolated from patient samples for in vitro testing. All samples were obtained at defined time points. The serum of levels of HSP70 were detected using a specific ELISA, uric acid serum levels were measured using the standard protocol of the central laboratory facility of the university hospital Tuebingen, Germany. The PBMCs were stimulated in vitro with synthetic peptide known to be expressed either on MHC-class-I molecules on tumor cells of a certain carcinoma (radiofrequency ablation) or with the peptides loaded onto dendritic cells used for vaccination. IFN-production was detected using RT-PCR, intracellular IFN-Staining and ELISPOT. Also, specific MHC-class-I tetramers were used to detect antigen specific cells directly. One of 9 vaccinated patients showed an increased activity of antigen specific T cells after several vaccinations. In 8 of 15 patients treated with radiofrequency ablation an increased IFN-production of specific T cells could be detected. None of 51 patients showed an increased serum level of uric acid one day after ablation. However, in about half of 24 patients an at the minimum 2-fold elevated level of HSP70 could be measured 24 hours after treatment. In a control group of patients with liver biopsy these elevated serum levels could not be detected. These results show the induction of an antigen specific immune response induced by both of the approaches. In principle, the vaccination with peptide pulsed dendritic cells could lead to an increase in activity of cytotoxic T cells. Radiofrequency ablation induces the systemic release of alarm signals and to the induction of an antigen specific T cell response. These results document an additive positive effect of radiofrequency ablation secondary to the treatment of localized lesions.