Calcium-abhängige T-Zell-Signaltransduktion und Multiple Sklerose: Vergleichende Analysen in humanen T-Zellen und Modellzellen für zelluläre Autoimmunität

Abstract

Moleküle der T-Zell-Signaltransduktion sind potentielle Ziele zur Immunmodulation. Eine Störung der T-Zell-Signaltransduktion nach unspezifischer oder Autoantigen-spezifischer Aktivierung könnte die Manifestation einer Autoimmunkrankheit begünstigen. In dieser Arbeit wurde die Genexpression von Komponenten der T-Zell-Signaltransduktion untersucht, die eine Schlüsselrolle bei der Calciumfreisetzung spielen. Diese Untersuchungen sind deskriptiv und beschäftigten sich mit der Frage, ob CD4+ T-Lymphozyten von Patienten mit einer Multiplen Sklerose eine Störung der Signaltransduktion aufweisen. Die Genexpression der an der Signaltransduktion beteiligten Proteinkinasen Fyn, Lck, ZAP-70, Tec und PLCgamma sowie die des Adapterproteins Vav wurde mittels real-time RT-PCR untersucht. Der Vergleich zwischen T-Zellen gesunder Probanden und Patienten mit Multipler Sklerose (n=10 pro Gruppe) ließen ein uneinheitliches basales Expressionsmuster erkennen. Bestimmte Stimulationsbedingungen führten bei T-Zellen von Patienten mit einer Multiplen Sklerose zu einer höheren Expression einzelner Parameter. Zur Untersuchung Antigen-spezifischer, CD4+ T-Helferzellen wurden Myelin-spezifische T-Zellen nach Stimulation mit Myelin-Antigenen mittels eines Il-2 Secretion Assay angereichert, ohne dass sich dabei andere Gesichtspunkte ergaben. Die Verfügbarkeit von zwei Transfektanten (58alpha/beta-T-Lymphomzellen aus der Maus), die einen transgenen humanen T-Zellrezeptor (TCR) bekannter Spezifität exprimierten, erlaubten eine eingehendere Analyse der aufgeführten Moleküle nach Antigen-spezifischer Stimulation. Die humanen T-Zellrezeptoren stammten aus zwei T Zellklonen eines MS Patienten und erkannten zwei Peptide des basischen Myelinproteins MBP80-99 bzw. MBP139-151. Die Transfektanten wiesen eine vergleichbare basale Transkriptionsaktivtät wie humane T-Zell-Lymphom-Zellen (Jurkat-Zellen) auf, zeigten aber bei der mitogenen Stimulation mit einem anti-CD3-Antikörper, wie auch in der Kombination mit einem mitogenen und einem kostimulierenden Antikörper (anti-CD3/anti-CD28) eine geringere Erhöhung der Genexpression als die Jurkat-Zellen. Die Antigen-spezifische Stimulation der Transfektanten mit MBP-Peptiden führte zu Repression aller untersuchten Gene. Die Darstellung der T-Zellaktivierung mittels Calcium–Imaging zeigte bei den Jurkat-Zellen eine stark positive zytoplasmatische Fluoreszenz. Die TCR-Transfektanten wiesen dagegen bei der antiCD3/antiCD28-Doppelstimulation, analog zu den Expressionsanalysen, ein geringeres Calcium-Signal auf. Diese Pilotuntersuchungen zeigen, dass die Analyse der T-Zell-Signaltransduktion auf der Ebene der Genexpression und der Calcium-Signalmessung für klinische Fragestellungen experimentell zugänglich ist und kann auf weitere Komponenten und Stimulationsparadigmen erweitert werden.

Molecules of the T-cell-signaltransduction are potential goals for immune modulations. A defect in the T-cell-signaltransduction cascade after non-specific or autoantigen-specific activation could promote manifestation of autoimmune diseases. In this study gene expressions of components of the T-cell-signaltransduction, playing a major role in calcium release, were analysed. The investigations are descriptive and examine the question, whether CD4+ T-cells of patients with multiple sclerosis have a defect in the signaltransduction. Gene expressions of the proteinkinases Fyn, Lck, ZAP-70, Tec and PLCgamma as well as the expression of the adapter protein Vav were analysed through real-time RT-PCR. The comparison between T-cells of healthy donors and patients with multiple sclerosis (n=10 per group) revealed a varied primary expression specimen. Definite conditions of stimulation in T-cells of patients with multiple sclerosis led to a higher expression of some parameters. To investigate antigen-specific CD4+ T-cells, myelin specific T-cells were enriched through Il-2 Secretion Assay after stimulation with myelin-antigens without another outcome. The availability of two transfectants (58alpha/beta-T-lymphoma-cells, mice) expressing a transgene human T-cell-receptor of known specifity, made it possible to analyse the defined molecules after antigen specific stimulation in detail. The human T-cell-receptors came from two T-cell-clones of a patient with multiple sclerosis and recognized two peptides of the myelin-protein MBP80-99 and MBP139-151. The transfectants had a similar primary transcription activity as human T-cell-lymphoma cells (Jurkat), but showed a lower gene expression increase with a mitogen stimulation (anti-CD3-antibody) or a combination with a costimulatory antibody (antiCD3/antiCD28) than the Jurkat cells. The antigen-specific stimulation of the transfectants with myelin peptides led to a repression of all examined genes. The representation of the T-cell-activation through Calcium-Imaging showed a strongly positive cytoplasmatic flourescence in Jurkat cells. The transfectants however had, analogous to the analyse of gene expressions, a lower Calcium signal. These pilot project shows that the investigation of T-cell-signaltransduction at the level of gene expression and Calcium signaling is experimental accessible for clinical questions and can be broadened to more components and conditions of stimulation.