Vergleichende molekularbiologische Untersuchung von Pilzbällen aus humanen Sinus maxillaris

Abstract

In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Inzidenz invasiver Mykosen stark zugenommen. Betroffen davon sind vorwiegend Patienten mit Immunsuppression. Ein Ziel der Arbeit war es, die Aspergillus-PCR mit Zielsequenz in der mitochondrialen DNA von Aspergillus spp. mit einer universellen PCR mit Zielsequenz in der fungalen 28S rDNA anhand histologisch gesicherter Pilzbälle aus humanen Sinus maxillaris zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass mittels Aspergillus-PCR mehr richtig positive Ergebnisse erzielt werden können. Vermutlich inhibiert der Einsatz universeller Primer z.T. die Amplifikation spezifischer Pilz-DNA. Zur Evaluation der Zygomyzeten-PCR wurde selbiges Probenmaterial untersucht. Zygomyzeten sind ubiquitär vorkommende Pilzspezies. Entgegen der Erwartung, DNA dieser Pilzspezies in Proben aus dem Respirationstrakt häufig nachweisen zu können, wurde in nur einer Probe DNA von Rhizomucor pusillus nachgewiesen. Es kann gefolgert werden, dass der Nachweis von Zygomyzeten auf eine Infektion zurückzuführen ist. Deshalb sollten diagnostische und therapeutische Schritte eingeleitet werden. Mit der Zygomyzeten-PCR gelingt der Nachweis von ubiquitär vorkommenden Basidiomycota. Es ist davon auszugehen, dass Basidiomycota aufgrund von Obstruktionen des Sinus im Nasen-Rachen-Raum persistieren und deshalb in den Proben in erheblichem Umfang nachweisbar sind ohne Rückschlüsse auf eine mögliche pathogene Bedeutung zu erlauben. Anhand weiterer Proben konnte gezeigt werden, dass die Primer der Aspergillus-PCR auch DNA von A. terreus, A. niger und A. flavus amplifizieren können. Deren Sequenzen wurden identifiziert und vergleichend dargestellt. Zudem kann mittels Aspergillus-PCR DNA weiterer Pilzgattungen wie Coccidioides posadasii und Histplasma capsulatum amplifiziert werden. Hingegen ist eine Amplifizierung der DNA von Zygomyzeten, Basidiomyzeten sowie einzelner getesteter Candida-Arten nicht möglich.

Background: Life threatening diseases in immunocompromised patients are often caused by ubiquitous filamentous fungi, such as aspergillus and zygomycetes. As the fungi show significantly different antifungal susceptibilities to antimycotic agents it is crucial to identify the causative pathogen to guide the antifungal treatment of invasive mold infections. Those different mycotic infections still cannot be distinguished and identidied sufficiently by available diagnostic methods. Aims: One aim of this thesis was to compare the Aspergillus-PCR targeting the mitochondrial DNA of Aspergillus spp. with a universal PCR targeting the fungal 28 S ribosomal DNA. DNA of 81 wax embedded tissue samples of fungus balls from human sinus maxillaris was examined. Results: Aspergillus-PCR was superior. Aspergillus fumigatus specific DNA was amplified in 48 of 81 samples by Aspergillus-PCR whereas universal PCR amplified specific DNA in 29 of 81 samples. Using universal primers possibly inhibits the amplification of specific fungal DNA. By sequencing products of the Aspergillus-PCR an identification of the Aspergillus species was possible. Aspergillus-PCR not only amplifies DNA of A. fumigatus but also of A. niger, A. terreus and A. flavus. To evaluate the seminested polymerase chain reaction (PCR) assay to identify mucormycosis targeting the 18S ribosomal DNA of zygomycetes these 81 samples were examined once again. Although spores of zygomycetes are considered to be ubiquitous DNA of zygomycetes was only detected in one of these examined 81 samples. The amplification of DNA from zygomycetes from samples of the respiratory tract indicates a severe infection and should be treated consistently.