Vergleich der Light-cycler-PCR mit anderen molekularbiologischen Nachweisverfahren zum Nachweis von Aspergillus- und Candida-DNA im Blut von Patienten nach allogener Knochenmarkstransplantation

Abstract

Patienten mit hämatologisch-onkologischen Erkrankungen oder Patienten nach Transplantationen sind gefährdet, sich eine lebensbedrohliche Pilzinfektion zuzuziehen. Mit einer möglichst früh eingeleiteten antimykotischen Therapie kann die Morbidität und die Mortalität dieser Patienten herabgesetzt werden. Dazu ist eine rasche, sensitive und speziesidentifizierende Diagnostik von großer Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit war es in erster Linie die LightCycler-Methode und die PCR-Elisa-Methode, aber auch andere Methoden, für die Routinediagnostik von Pilzen so anwendbar zu machen, dass der Verlust an Sensitivität und Spezifität möglichst gering gehalten wird, trotzdem aber am Tag der Blutentnahme ein Ergebnis vorliegen kann. Die Versuche zur Extraktion haben gezeigt, dass die Methode mit RCLB, WCLB und Lytikase, mit niedrigerer Zentrifugalkraft, dafür aber mit größeren Ausgangsvolumina die besten Ergebnisse lieferte. Diese Methode wurde zur Extraktion der Pilz-DNA für den PCR-Elisa als auch für das LightCycler-Verfahren angewendet. Im Hauptteil dieser Arbeit wurde die LightCycler- mit der PCR-Elisa-Methode anhand von 846 Blutproben von Patienten nach Knochenmarks- oder Stammzelltransplantation verglichen. Im Vergleich der Ergebnisse dieser Studie wird deutlich, dass der PCR-Elisa im Bereich niedriger Pilzlast im Blut wesentlich häufiger positive Ergebnisse liefert, teilweise auch ohne klinisches Korrelat, der LightCycler aber eher im Bereich höherer Pilzlast Pilze im Blut detektiert. Die PCR- ist zur Screening-Blutuntersuchung besonders geeignet, da sie durch eine ausgezeichnete Sensitivität besticht, die LightCycler-Diagnostik ist aufgrund der geringeren Sensitivität gegenüber des PCR-Elisa's eher zur Quantifizierung der Pilzlast in positiven klinischen Proben geeignet.

Patients with haematological-oncological diseases or patients after transplantations are in danger of a fungal infection. With an antimycotical therapy beginning as soon as possible a decrease of morbidity and mortality of these patients can be achieved. Therefore an early, quick and sensitive diagnostic-method is of great importance. The aim of this work was to compare the LightCycler- with the PCR-Elisa-method and to modify these methods so that the loss of sensitivity and specifity is as insignificant as possible and that the result of the blood sample can be known within one day. The comparison of LightCycler with PCR-Elisa by using 846 blood samples makes clear that the PCR-Elisa-method in the range of lower fungal-load shows more often positive results than the LightCycler-method. Therefore the PCR-Elisa-method is especially suitable for screening-examinations and the LightCycler-method for quantification of the fungal-load in positive samples.