Untersuchungen zur Regulation der Kohlenmonoxid-bedingten Stimulation der Erythropoetinsekretion bei der Ratte

Abstract

Hintergrund: Die Synthese des Glykoproteins Erythropoetin (EPO) korreliert invers mit dem Sauerstoffangebot des arteriellen Blutes und steigt unter Hypoxie bis zu tausendfach. Es wird in der Literatur kontrovers diskutiert, inwieweit das autonome Nervensystem und seine Transmitter, die renale Gewebemenge oder die Durchblutung von Niere und Leber die EPO-Sekretion regulieren.

Zielsetzung: In der vorliegenden Arbeit wurde anhand mikrochirurgischer Techniken sowie durch die Gabe verschiedener Neurotransmitter der Einfluss des autonomen Nervensystems, der renalen Gewebemenge und die Durchblutung von Leber und Niere auf die EPO-Sekretion untersucht.

Methoden: Alle Versuche wurden in einem Modell Kohlenmonoxid (CO)-induzierter Hypoxie an nicht narkotisierten männlichen Sprague-Dawley Ratten durchgeführt. Hierzu wurde eine Dosis-Wirkungskurve der EPO-Spiegel im Serum, bezogen auf CO-Konzentrationen zwischen 0 und 1400 ppm CO, erstellt. Im ersten Teil der Arbeit wurden die EPO-Konzentration im Serum und die renale EPO-mRNA nach renaler Denervierung und Gabe von Propranolol (unselektiver beta-Adrenozeptorantagonist), Isoproterenol (unselektiver beta-Adrenozeptoragonist), Neuropeptid Y (NPY) und einem NPY-Antagonisten nach CO-Exposition bestimmt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde mittels unilateraler oder subtotaler Nephrektomie der Einfluss der renalen Gewebemenge auf die EPO-Produktion untersucht. Die Durchblutung der Niere wurde vor CO-Exposition durch arterielle Stenosierung oder akute und chronische Ureterligatur im dritten Teil der Arbeit verändert. Im vierten Teil wurde geprüft, ob durch Arterialisierung der Leber über einen porto-renalen Shunt die EPO-mRNA-Expression in der Leber verändert werden kann. Teil fünf befasst sich mit den Auswirkungen von Hypoxie auf das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS).

Ergebnisse: Die renale Denervierung bewirkte eine Linksverschiebung der Dosiswirkungskurve mit signifikant erhöhter EPO-Serumkonzentration bei mittlerer hypoxischer Stimulation (600 ppm CO). NPY konnte die Steigerung der EPO-Sekretion denervierter Tiere signifikant senken. NPY-Antagonisten sowie beta-adrenerge Blockade oder Stimulation veränderten die EPO-Sekretion nicht. Die Reduktion der renalen Gewebemasse durch einseitige/subtotale Nephrektomie senkte die EPO-Serumkonzentration und die renale EPO-mRNA-Expression unter starkem hypoxischen Stimulus, nicht jedoch unter milder Hypoxie. Eine akute Ureterligatur steigerte die EPO-Synthese signifikant. Nach chronischer Ligatur des linken Ureters wurde bei 600 ppm CO eine signifikante Verringerung der EPO-Serumkonzentration und des EPO-mRNA-Gehaltes der linken Niere im Vergleich zu Tieren mit akuter Ligatur des linken Ureters gemessen. Eine 70%ige Stenosierung der linken Nierenarterie veränderte EPO-Serumkonzentration und renalen EPO-mRNA-Gehalt nicht. Die EPO-Synthese in der Leber ließ sich durch starke hypoxische Stimulation bei Kontrolltieren um bis zu 28fach steigern. Die EPO-mRNA in der Leber betrug CO-konzentrationsabhängig zwischen 4% bis 7% des renalen EPO-mRNA-Gehaltes. Eine Oxygenierung des Pfortaderblutes vermochte die hepatische EPO-mRNA-Expression nicht zu verändern. Nur für das Modell der subtotalen Nephrektomie konnte eine signifikante Supprimierung der Plasmareninaktivität (PRA) gezeigt werden. Zwischen den übrigen genannten Gruppen waren keine Unterschiede in der PRA zu beobachten.

Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse zeigen, dass das renale Nervensystem eine Rolle bei der Regulation der EPO-Sekretion spielt. NPY übt über die renalen Nerven eine tonische Hemmung auf die EPO-Produktion aus. Nach Entfernung von renaler Gewebemasse kann die Restniere bis zu einer Konzentration von 800 ppm CO den Verlust von Epozyten kompensieren. Bei stärkeren hypoxischen Stimuli sinkt die EPO-Synthese. Die renale Hypoperfusion nach Stenosierung der Nierenarterie scheint kein ausreichender Stimulus für eine Steigerung der EPO-Synthese zu sein. Die erhöhte EPO-Produktion nach akuter Ureterligatur lässt vermuten, dass es hierbei durch den gesteigerten renalen Blutfluss (RBF) und folglich erhöhter tubulärer Reabsorptionsarbeit zu einer verstärkten Hypoxie mit vermehrter Stimulation der EPO-produzierenden Zellen kommt. Dagegen führt eine chronische Ureterligatur zu einer Supprimierung der EPO-Produktion. Es bleibt unklar, ob hierfür der Funktionsverlust der EPO-produzierenden Zellen oder ein verminderter O2-Verbrauch der proximalen Tubuli verantwortlich ist. Die Antwort der Leber auf hypoxischen Stimulus erscheint unabhängig vom Sauerstoffgehalt des Pfortaderblutes. Eine Reaktivierung EPO-produzierender Hepatozyten scheint somit nicht möglich zu sein. Nur für das Modell der subtotalen Nephrektomie konnte eine signifikante Senkung der PRA gezeigt werden. Eine Beteiligung des RAAS an der Regulierung der EPO-Synthese ist unter den beschriebenen Versuchsbedingungen unwahrscheinlich.

Background: Erythropoietin (EPO), a glycoprotein hormone, is an essential growth factor which regulates erythropoiesis and is predominantly synthesized in the kidneys. EPO secretion and renal mRNA content are inversely correlated to renal oxygen supply. Previous studies have shown that renal ischemia in isolated perfused kidneys elicited a much weaker EPO secretory response compared to systemic hypoxia in vivo, indicating that additional factors may contribute to the EPO secretory response to hypoxia. Despite the fact that several studies investigated the role of renal sympathetic nerves, renal oxygen supply and consumption or reduced renal mass on the regulation of EPO secretion, contradictory results have been reported.

Objective: Thus, we re-examined the role of the renal nervous system and its transmitters in carbon monoxide (CO) induced EPO secretion. We further analysed the role of progressive renal disease in the EPO response following CO exposure by using the remnant kidney model. We also investigated the responsiveness of the EPO gene to diminished oxygen consumption in the hydronephrotic kidney, resulting from ureter ligation. In addition, we examined the effect of changes in oxygen supply to kidney and liver on EPO secretion. To clarify the role of the renin-angiotensin-aldosterone system (RAS) on the EPO response, we measured plasma renin activity (PRA) in all experimental groups.

Methods: All experiments were carried out in a model of CO induced hypoxia in male Sprague-Dawley rats by constructing a dose response relationship between the degree of hypoxia and EPO secretion. Following bilateral denervation, rats were exposed to different CO concentrations. To compensate the lack of transmitter release in denervated rats we administered [Leu31, Pro34]-Neuropeptide Y (NPY) or isoproteronol. To block these neurotransmitters in control rats we administered the beta-adrenergic receptor blocker propranolol or a specific NPY receptor blocker. In a second set of experiments we compared renal EPO mRNA and EPO serum levels in rats following five-sixths nephrectomy or uninephrectomy with sham-operated controls under conditions of normoxia and hypoxia. Furthermore, we modified renal oxygen consumption and supply by reducing renal blood flow (RBF) below 70% of normal or by performing acute and chronic unilateral ureteral ligation. Finally, we investigated whether portal vein arterialization was able to increase EPO mRNA expression in the liver. In all experimental groups PRA was measured.

Results: Serum EPO levels and in parallel renal EPO mRNA expression were elevated in rats with bilateral renal denervation compared to innervated rats following exposure to 600 ppm CO . This increase of EPO secretion in denervated rats could be blocked by administration of NPY, whereas the NPY receptor antagonist did not affect EPO secretion in control animals. Agonists and antagonists of beta-adrenergic receptors had no effect on EPO secretion. Reduction of the renal mass by unilateral or five-sixths nephrectomy exhibited a significant reduced EPO secretory response following severe hypoxic stimulation. The decrease of renal EPO mRNA content was stronger in five-sixths nephrectomized rats compared to unilateral nephrectomized controls. Following CO exposure, acute unilateral ureteral ligation induced a significant raise in EPO serum level and renal EPO mRNA, whereas twenty-four hours of persisting left ureteral ligation significantly decreased EPO serum levels and renal EPO mRNA. Stenosis of the left renal artery with a renal artery clamp did not affect renal EPO mRNA expression and EPO serum levels. Hepatic EPO mRNA content in control animals exposed to different CO concentrations increased up to 28fold compared to baseline concentration. Portal vein arterialization did not affect hepatic EPO mRNA expression. Five-sixths nephrectomy significantly decreased PRA.

Conclusion: Our data suggest that renal nerves contribute to the half-maximal EPO secretory response to CO exposure, possibly via NPY receptors. Our results further indicate that the remnant kidney can partially compensate the loss of renal mass, likely due to a hypertrophy of EPO producing cells. Acute unilateral ureteral ligation increased renal EPO production, signifying that there is a direct relationship between EPO production and tubular oxygen consumption. It appears likely that changes in renal morphology in response to chronic ureteral obstruction reduce EPO synthesis, independent of oxygen delivery. The reduced energy-consuming transport activity of the tubular cells in hydronephrotic kidneys may direct affect the synthesis of the hormone. Hepatic oxygen supply seems not to be a dominant factor in the control of hepatic EPO secretion. Our findings indicate that the RAS is influenced by the degree of renal ablation.