Einfluss des "Repulsiven Guidance Moleküls" (RGM) auf die Proliferation und Differenzierung intestinaler Stammzellen

Abstract

Das ‚repulsive guidance molecule’ (RGM) ist ein erst vor kurzem analysiertes Protein aus dem ZNS, welches mittlerweile auch in endodermalen Geweben des Mausembryo identifiziert wurde. Es handelt sich hierbei um ein über einen GPI-Anker membranassoziiertes Protein von 33 kDa Größe und hat keine Sequenzhomologien zu anderen bekannten Leitmolekülen. Bisher wurden in der Maus die drei Subtypen RGMa, RGMb und RGMc identifiziert. In neuronalen Zellen des ZNS wirkt RGM anti-apoptotisch, zeigt repulsive, axon-spezifische guidance-Aktivität und wirkt in der frühembryonalen Entwicklung beim Verschluss des Neuralrohres mit. Der entsprechende RGM Rezeptor ist Neogenin, das eine 50%ige Homologie mit dem Tumorsuppressorgen DCC (deleted in colorectal cancer) aufweist. Über biologische Funktionen von RGM ausserhalb des ZNS gibt es bislang wenig Erkenntnisse. Das Ziel der Doktorarbeit bestand in einer ausführlichen Analyse des entwicklungsabhängigen Expressionsprofils der drei bisher identifizierten RGM-Subtypen sowie des Rezeptors Neogenin im murinen Darm. Desweiteren sollte ein möglicher Einfluss des RGM-Neogenin Systems auf Proliferations- und Differenzierungsvorgänge epithelialer und enterischer Stamm- bzw. Vorläuferzellen untersucht werden. In der Expressionsanalyse konnte sowohl für den Dünn- als auch für den Dickdarm gezeigt werden, dass die Subtypen RGMa und RGMb in den embryonalen (E14, E18) und früh postnatalen Stadien (P0-P7) im enterischen Nervensystem exprimiert werden. Eine Woche nach der Geburt (P7) wurden beide Subtypen zusätzlich auch im unteren epithelialen Kryptenkompartiment d.h. im epithelialen Progenitor- und Stammzellkompartiment identifiziert. RGMc konnte während der gesamten Darmentwicklung nicht detektiert werden. Im Gegensatz zu RGMa und RGMb wurde der Rezeptor Neogenin kontinuierlich in enterischen Ganglien und im epithelialen Kryptenkompartiment exprimiert. Die entsprechende Analyse wurde sowohl auf mRNA (In situ Hybridisierung, RT-PCR) als auch auf Proteinebene (Immunhistochemie, Western Blot) durchgeführt. Durch Doppelfärbungen mit zelltypspezifischen Antikörpern wurde die RGM und Neogenin Expression in den verschiedenen Zelltypen charakterisiert. Dabei ließ sich der Ligand als auch der Rezeptor in differenzierten enterischen Neuronen und Glia, Panethzellen des Dünndarmepithels und undifferenzierten Stamm- und Vorläuferzellen des Kryptenepithels nachweisen. Das entwicklungsabhängige Expressionsprofil des RGM-Neogenin Systems deutete darauf hin, dass diese Moleküle an der intestinalen Stammzelldetermination beteiligt sind. Um dies näher zu untersuchen, wurden in vitro Proliferations- und Migrationsassays mit primären fötalen enterischen Ganglienzellen und epithelialen Kolon-Karzinomzellen (Caco-2) durchgeführt. Eine signifikante Hemmung von RGMa auf die Zellwanderung von Caco-2 Zellen konnte im Boyden-Kammern-Assay gezeigt werden. Für Migrations- Auswachsversuche mit enterischen Ganglienzellen wurden kultivierte Neurosphären verwendet, die zuvor aus neuralen Vorläuferzellen des fötalen Darms generiert wurden. Das Auswachsen der Neuriten konnte signifikant inhibiert werden, wenn die Neurospheren mit RGMa produzierenden Hek-293 Zellen ko-kultiviert wurden. Umgekehrt ließ sich durch Zugabe von rekombinantem RGMa ein Kollaps der Neuriten ausdifferenzierter Ganglien induzieren. Der Effekt von RGMa konnte sowohl bei den Caco-2 Zellen als auch bei den enterischen Ganglienzellen durch Blockierung des Neogenin-Rezeptors aufgehoben werden. Diese Versuche bestätigten, in Analogie zum ZNS, die repulsiven Eigenschaften von RGMa auch außerhalb des ZNS. Ein Effekt von RGMa auf die Proliferation von Epithelzellen sowie enterischer Ganglienzellen konnte nicht nachgewiesen werden. Zusätzlich zu den in vitro Versuchen wurde ein Neogenin Knockout Mausmodell hinsichtlich der Einflüsse auf Proliferation und Differenzierung analysiert. Im embryonalen Darm konnte eine Verzögerung der primären Darmbesiedelung mit enterischen Vorläuferzellen beobachtet werden. Im adulten Darm konnte im Vergleich zum Wildtyp eine signifikante Reduktion der epithelialen Proliferation und eine Reduktion enterischer Ganglien im plexus myentericus beobachtet werden. Die Abnahme der Proliferation im Epithel hatte keinen signifikanten Einfluß auf die differenzierte Epithelpopulation. Zusammen mit der Expressionsanalyse, den in vitro Befunden zur Migration sowie der Untersuchung der Neogenin Knockout Maus, deuten die Ergebnisse stark darauf hin, dass Neogenin zusammen mit seinen Liganden an der Regulation des epithelialen und enterischen Stammzellkompartiments beteiligt ist.

The ‚repulsive guidance molecule’ (RGM) is a recently analyzed protein in the CNS which has been also identified in endodermal tissues of the mouse embryo in the meantime. It is a GPI-anchored, membrane-associated glycoprotein of 33 kDa which has no significant homology to any other known guidance molecules. Three homologues, RGMa, RGMb and RGMc, were identified in the murine embryo. Functional studies in the CNS demonstrated that RGM is involved in neuronal cell survival, shows repulsive axon-specific guidance activity, and plays a role in neural tube closure during embryogenesis. Neogenin, a protein with about 50 % homology to the tumor suppressor gene DCC (deleted in colorectal cancer), was demonstrated to function as a RGM receptor. However, a biological function of RGM outside the CNS remained to be elucidated. The main goal of this doctoral thesis was an extensive development dependent expression analysis of all identified RGM subtypes and of the receptor Neogenin in the murine intestine. Furthermore, possible influences of the RGM-Neogenin system on proliferation and differentiation of epithelial and enteric stem and progenitor cells should be analyzed. The expression analysis revealed that RGMa and RGMb but not RGMc were strongly expressed in the enteric nervous system of the embryonic (E14, E18) and postnatal gut (P0-P7). One week after birth (P7) an additional expression of RGMa and RGMb was observed in the lower crypt region of the intestinal epithelium, which is known as the epithelial stem and progenitor compartment. In contrast to the RGM subtypes the Neogenin receptor could be demonstrated in all investigated stages in both enteric ganglia and epithelial crypts. The analysis were performed on mRNA (In situ Hybridisierung, RT-PCR) as well as protein level (Immunohistochemistry, Western Blot). Expression of RGM and Neogenin in the different cell types was shown by co-labeling experiments. Thus, co-expression occured in differentiated enteric neurons and glia, Paneth cells, and undifferentiated stem and progenitor cells of the crypt epithelium. The development dependent expression pattern indicated that these molecules may play a role in the intestinal stem cell determination. To address this, we performed in vitro proliferation and migration assays by using the epithelial colon carcinoma cell line Caco-2 as well as primary fetal enteric ganglia cells of the mouse. A significant inhibition of RGMa on cell migration of Caco-2 cells could be demonstrated in the Boyden chamber migration assay. To investigate the migration and neurite outgrowth of enteric ganglia we used neurospheres which were generated from expanded neural progenitors of the fetal gut. The neurite outgrowth was significantly inhibited after co-cultivation of neurospheres with RGMa producing Hek-293 cells. Conversely, addition of recombinant RGMa induced a collapse response of the neurites of differentiated ganglia. The observed RGMa effects on Caco-2 as well as enteric ganglia cells could be blocked by addition of a Neogenin antibody. These experiments are in analogy to the known repulsive effects of RGMa in the CNS. However, an RGMa effect on proliferation of Caco-2 as well as enteric ganglia cells could not be demonstrated. To further elucidate the biological relevance of the RGM/Neogenin system we analyzed the influences on proliferation and differentiation in the intestine of Neogenin knockout mice. In the embryonic gut (E12) we observed a delay in the primary migration by enteric progenitor cells. Further, in comparison to the adult wildtype gut we could demonstrate a significant reduction of enteric ganglia within the plexus myentericus as well as proliferation within the epithelium. The reduced proliferation within the epithelium had no effect on differentiated cells. Taken together, the expression data, the in vitro experiments, and the analysis of the Neogenin knockout mice strongly suggest a participation of Neogenin and its ligands in the regulation of the epithelial and enteric stem cell compartment.