Stellenwert von Determinanten des 5-Fluorouracil-Stoffwechsels beim Kolonkarzinom im UICC-Stadium III

Abstract

Kolorektale Karzinome stellen die zweithäufigste Karzinom-Entität in Deutschland dar. Während die chirurgische Resektion nach wie vor den Hauptpfeiler der Therapie bildet, gewinnen adjuvante zytostatische Therapiestrategien zunehmend an Bedeutung. Dabei stellt 5-Fluorouracil (5-FU) einen unverzichtbaren Bestandteil dar. In den vergangenen Jahren gelang es, etliche am Stoffwechsel von 5-FU beteiligte Enzyme zu identifizieren. Unverändert ist unklar, ob die quantitative Analyse einzelner oder eine kombinierte Betrachtung mehrerer dieser Enzyme eine Vorhersage des klinischen Erfolges erlaubt und welche Methode hierbei die zuverlässigste Aussage ermöglicht.

In dieser Arbeit sollte die Rolle der am 5-FU-Stoffwechsel beteiligten Enzyme Thymidilat-Synthase (TS), Thymidin-Phosphorylase (TP) und Dihydropyrimidin-Dehydrogenase (DPD) näher untersucht werden. Nach präklinischen Daten verläuft die Inaktivierung von 5-FU über die DPD, das Enzym TP überführt 5-FU in einen zellschädigenden aktiven Metaboliten, während die TS durch eine Hemmung durch diesen Metaboliten in ihrer Funktion in der DNA Synthese gestört wird. Grundsätzlich erlauben neue PCR-Technologien eine quantitative Einschätzung der Expressionsstärke von spezifischen Proteinen in Geweben. Die immunhistochemische Färbung kann ebenfalls eine adäquate Einschätzung der Expressionsstärke liefern und ermöglicht die Korrelation von Expression und morphologischer Lokalisation. Vor diesem Hintergrund war die Möglichkeit der quantitativen Enzym-Analyse mittels relativer mRNA-Expressionsbestimmung über eine Real-time-PCR aus in paraffin-eingebettetem Tumormaterial für die genannten Enzyme zu klären. Diese Ergebnisse sollten mit einer zu etablierenden semiquantitativen immunhistochemischen Analyse im Sinne einer Äquivalenzprüfung verglichen werden. Schliesslich sollte ein erster Vergleich der mit den jeweiligen Methoden gefundenen Aktivitäten mit klinischen bzw. histopathologischen Eigenschaften und prognostischem Verlauf, eine Rangliste der in weiteren Untersuchungen zu adressierenden Enzyme und Methoden aufzeigen.

Den Untersuchungen wurde eine Stichprobe von 46 in paraffin-eingebetteten Tumorresektaten aus einem Kollektiv von 204 kurativ operierten und mit 5-FU behandelten Kolonkarzinompatienten im Stadium III (UICC) zugrundegelegt.

Es konnte gezeigt werden, dass aus formalinfixiertem und in paraffin-eingebettetem Tumormaterial eine quantitative RNA-Analyse für die untersuchten Enzyme möglich ist. Ebenfalls konnte für die drei Proteine eine immunhistochemische Färbung etabliert werden. Der Methodenvergleich zwischen Immunhistochemie und Real-time-PCR zeigte eine Übereinstimmung der Ergebnisse für die Thymidylat-Synthase, Thymidin-Phosphorylase und Dihydropyrimidin-Dehydrogenase in 50,0 %, 63,0 % und 60,5 % der untersuchten Proben. Weder für die immunhistochemisch bestimmte Proteinexpression noch für die mRNA-Expression eines der untersuchten Enzyme, fand sich eine signifikante Korrelation mit klinischen oder histopathologischen Parametern.

Im Hinblick auf den klinischen Verlauf ergab sich eine statistisch signifikante Bedeutung bei der kombinierten Betrachtung von TS und DPD. Danach war die Verknüpfung aus hoher TS- und niedriger DPD-mRNA-Expression mit einem längeren rezidivfreien Überleben (p= 0,048) und tendenziell auch mit einem längeren Gesamtüberleben (p=0,076) korreliert. Immunhistochemisch bestand für diese Kombination dagegen kein statistisch signifikanter prognostischer Einfluss (p=0,38). Bei Betrachtung der einzelnen Enzyme zeigte sich auf mRNA-Ebene für Patienten mit hoher TS-Expression eine Tendenz zu einem längeren rezidivfreien Überleben (p=0,09). Bei der Überprüfung der Thymidin-Phosphorylase fand sich ein tendenzieller Überlebensvorteil sowohl für eine hohe mRNA- als auch für eine hohe Proteinexpression (p=0,27). Für die Dihydropyrimidin-Dehydrogenase zeigte sich eine Tendenz zwischen einer niedrigen Protein- bzw. mRNA-Expression und einem längeren Gesamtüberleben (p=0,09).

Die erarbeiteten Ergebnisse belegen, dass auch im archivierten Tumormaterial die quantitative RNA-Bestimmung für TS, TP und DPD möglich ist. Erwartungsgemäss fand sich kein Zusammenhang von Aktivitäten der am 5-FU-Stoffwechsel beteiligten Enzyme mit anderen klinischen oder histopathologischen Tumoreigenschaften. Obwohl es nicht primäres Ziel der vorliegenden Arbeit war, eine auch nur vorläufig abschliessende Einschätzung zur prädiktiven Bedeutung der drei Enzyme zu geben, scheinen allerdings die Ergebnisse dieser Arbeit die präklinischen Daten zu bestätigen. Außerdem scheint es einen Vorteil bei der kombinierten Betrachtung von mehreren am 5-FU-Stoffwechsel beteiligten Enzymen zu geben. Die hier vorgelegten Daten lassen sowohl eine weitere kombinierte Betrachtung der TS- und DPD-mRNA-Expression als sinnvoll erscheinen, als auch eine immunhistochemische Untersuchung der TP- als auch der DPD-Expression.

Colorectal Carcinomas belong to the most frequent malignancies. While surgical resection is still the basic therapy, cytostatic treatment becomes more and more important. In this context, 5-Fluorouracil (5-FU) plays a crucial role. In the last years, a number of enzymes involved in the 5-FU metabolism have been identified. However, it is still unknown, whether the quantitative analysis of one single enzyme or whether the combined examination of several enzymes allows a prediction of the clinical outcome and which method herein provides the most reliable results.

In this investigation the role of three enzymes involved in the 5-FU metabolism, namely thymidylate synthase (TS), thymidine phosporylase (TP) and dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD), should be further characterized. According to preclincal data, 5-FU is inactivated by DPD, TP converts 5-FU into an active cytotoxic metabolite whereas TS is inhibited by this active metabolite in its function in DNA synthesis. In principal, new PCR technologies allow a quantitative analysis of specific protein expression in tissues. Immunohistochemical staining can also give an adequate assessment of protein expression and allows the combined analysis of expression and morphology. On this background, the possibility of quantitative mRNA expression of the mentioned enzymes was studied within paraffin-embedded tissue specimens by Real-time PCR. These results should be compared with a semi quantitative immunohistochemical expression analysis which had to be established. Finally, a first preliminary comparison of the found activities with the clinical and histopathological characteristics and an estimation of their predictive value should provide a ranking of enzymes and indicate the best method for further investigations.

In this investigation, a sample of 46 paraffin-embedded tumour tissues out of a total of 204 colon cancer patients treated by surgery and 5-FU based chemotherapy has been used. It could be shown that a quantitative analysis of the RNA of the mentioned enzymes within formalin-fixed and paraffin-embedded tumour tissue is possible. Also, an immunohistochemical staining could be established for all three enzymes.

The comparison of immunohistochemistry and real-time PCR showed a correspondence of the results for thymidylate synthase, thymidine phosphorylase and dihydropyrimidine dehydrogenase in 50.0%, 63.0% and 60.5% of samples. Neither for immunohistochemical protein expression nor mRNA expression a significant correlation between clinical and histopathological parameters was found. Regarding the clinical outcome, a significant correlation was found in the combined examination of TS and DPD. A high TS and low DPD mRNA expression was associated with a longer disease-free survival (p=0.048) and a trend to longer overall survival (p=0.076). In immunohistochemical analysis, a prognostic correlation (p=0.38) was not observed. In the single analyses, there was found a trend towards a longer disease-free survival for patients with a high TS mRNA expression (p=0.09). A trend for longer overall-survival was found both for high TP mRNA expression and high TP protein expression (p=0.27). Also a trend for longer overall survival was observed for low DPD mRNA and protein expression.

The presented results prove that a quantitative mRNA analysis of TS, TP and DPD of paraffin-embedded material is possible. As expected, no correlation between the activities of enzymes involved in metabolism of 5-FU with other clinical or histopathological data was detected. Although, it was not the overall aim to give an assessment of the predictive value of the analyzed enzymes, the results of this investigation confirm the preclinical theories. There also seems to be an advantage in the combined analysis of several enzymes involved in metabolism of 5-FU. This data suggest to analyze in further investigations both the combined examination of TS and DPD mRNA expression and an immunohistochemical analysis of TP and DPD expression.