Funktionelle Architektur der Kleinhirnkerne der Ratte - Untersuchungen zur Membranphysiologie, Morphologie und glycinergen synaptischen Transmission der Kleinhirnkernneurone

Abstract

Informationen aus dem Kleinhirnkortex erreichen nur unter Vermittlung der Kleinhirnkerne die nachgeschalteten Zentren des Hirnstammes, des Mittelhirns und des Thalamus. Obwohl die efferenten und afferenten Verbindungen der Kerne wohlbekannt sind, bestehen nur wenige Untersuchungen, die sich mit der Konnektivität der Kleinhirnkernneurone selbst befassen. Üblicherweise unterscheidet man in den Kleinhirnkernen, mit Blick auf die verwendeten Neurotransmitter und Projektionsziele, drei unterschiedliche Klassen von Neuronen. Ob sich diese anatomisch definierten Neuronentypen auch hinsichtlich ihrer elektrischen Membraneigenschaften unterscheiden, ist bisher nur unzureichend bekannt und war Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Den zweiten Schwerpunkt dieser Arbeit bildeten elektrophysiologische Untersuchungen zur Rolle von Glycin in der inhibitorischen synaptischen Transmission der Kleinhirnkerne. Zur Untersuchung dieser Fragestellungen wurden Kleinhirnkernneurone unterschiedlichen Alters und Größe mittels Patch Clamp- Technik in der Ganzzellkonfiguration unter Sichtkontrolle abgeleitet. Für die Bestimmung des Neurotransmittergehaltes der zuvor charakterisierten Neurone kamen immunhistochemische Methoden zur Anwendung. Um zu garantieren, dass von Neuronen unterschiedlicher Größe abgeleitet wurde, wurden die Neurone vor der Ableitung gezeichnet und ihre Somagröße ermittelt. Die untersuchten Kleinhirnkernneurone unterschieden sich elektrophysiologisch hinsichtlich des Vorhandenseins bzw. Nichtvorhanden-seins von Plateaupotentialen, dem Ausmaß ihrer Reboundantwort nach Beendigung hyperpolarisierender Strompulse sowie hinsichtlich der Form ihrer Aktionspotentiale und Nachhyperpolarisationen. Die genauere Analyse der elektrophysiologischen und morphologischen Eigenschaften der Neurone erlaubte in Anlehnung an Czubayko et al. (2001) die Differenzierung der Gesamtpopulation in sogenannte Typ I- oder Typ II- Neurone. Zusätzlich zu dieser Einteilung fanden sich Neurone mit überlappenden Eigenschaften, die als Mix- Neurone bezeichnet wurden. Obwohl diese Zellen Plateaupotentiale generierten waren sie hinsichtlich ihrer Kinetik eher mit den Typ II- Neuronen vergleichbar. Die Clusteranalyse der elektrophysiologischen Eigenschaften der Kleinhirnkernneurone unterstützte die Hypothese einer möglichen weiteren Unterteilung der zyklisch feuernden Neurone in Typ I- und Mix- Neurone. Aufgrund der geringen Größe, ihrer Seltenheit und der starken Verletzbarkeit der Typ II- Neurone, was im Zusammenspiel mit der erhöhten Gefahr, die Neurone mit der Elektrode aus dem Hirnschnitt zu ziehen, auf einen schmalen Dendritenbaum hinweisen könnte, könnte es sich bei den Typ II- Neuronen um Interneurone der Kleinhirnkerne handeln. Die morphologisch heterogene Gruppe der Typ I- und Mix- Neurone könnte sowohl glutamaterge als auch GABAerge Projektionsneurone umfassen. Leider lieferte die anschließende immunhistochemische Färbung keinen weiteren Hinweis über die Richtigkeit der Hypothese, dass es sich bei den elektrophysiologisch ermittelten Gruppen tatsächlich um unterschiedliche Neuronenklassen handeln könnte. Die Untersuchung der Funktion von Glycin als synaptischer Neurotransmitter in den Kleinhirnkernen zeigte, dass glycinerge Synapsen in neonatalen und jung-adulten Neuronen vorhanden und funktional sind, während sie während des jugendlichen Alters (P13 bis P17) eine vorübergehende, nicht- funktionale, Phase durchlaufen. Zum Badmedium beigefügtes Glycin induzierte in Neuronen jeden Alters und Größe einen strychninsensitiven, einwärtsgerichteten Strom, was auf das Vorhandensein funktionaler inhibitorischer Glycinrezeptoren während der gesamten untersuchten Altersphase hindeutet. Strychninsensitive IPSCs waren jedoch nur in neonatalen und jung- adulten Neuronen nachweisbar und auch nur in Neuronen mit großen Somata. Die wahrscheinlichste Quelle dieser IPSCs sind die glycinergen Neurone der Kleinhirnkerne, bei denen es sich vermutlich um Interneurone (und hierbei möglicherweise um die zuvor gezeigten Typ II-Neurone), handelt. Der fehlende Nachweis glycinerger Synapsen kleiner und mittelgroßer Neurone könnte auf eine extrasynaptische Lokalisation der GlyR hindeuten. Das Fehlen strychninsensitiver IPSCs in Kleinhirnkernneuronen jugendlichen Alters spricht für das Vorliegen nicht- funktionaler, „stiller“, Synapsen. Eine Analyse der IPSC- Kinetik sowie der Blockierbarkeit der Glycinrezeptoren durch Pikrotoxin lieferte Hinweise für einen Wechsel der α- Untereinheit des Glycinrezeptors während der Phase stiller Synapsen im jugendlichen Alter. Diese nicht- funktionale Phase glycinerger Synapsen könnte eine Folge der Umorganisation der postsynaptischen Region während der Ausreifung von Glycinrezeptoren sein. Die Ergebnisse dieser Studie tragen zum Verständnis der funktionellen Bedeutung einer glycinergen Neurotransmission in den Kleinhirnkernen bei, eine Bedeutung, die bislang unterschätzt wurde. Glycin könnte unter physiologischen und pathologischen Gegebenheiten im sich entwickelnden als auch im ausgereiften Nervensystem eine essentielle Rolle für die Aufrechterhaltung der cerebellären Funktion spielen. Darüber hinaus geben diese Ergebnisse erstmalig einen Hinweis für das Vorhandensein stiller Synapsen im sich entwickelnden glycinergen System und veranlassen zu der Vermutung, dass diese Synapsen nicht nur eine wichtige Rolle in der Feinabstimmung des neuronalen Netzwerkes der Kleinhirnkerne sondern darüber hinaus auch in anderen Hirnarealen spielen könnten.

The neurons of the deep cerebellar nuclei (DCN) comprise the main output stage of the cerebellum. They receive GABAergic inhibitory drive from cortical Purkinje cells and glutamatergic excitatory input from climbing and mossy fibre collaterals (Shinoda et al., 1993, Teune et al., 1998, Czubayko et al., 2001). As a consequence, the output of the neural computation, performed in the cerebellum, is reflected in the firing patterns of the DCN neurons, which then are translated into different motor functions through projections to a variety of premotor centers, including the thalamus, red nucleus and superior colliculus, and the inferior olive (Teune et al., 1998, Aizenman and Linden, 1999). The cerebellar output is generated as a result of synaptic interaction in the DCN and by the electrical membrane properties of these neurons themselves. Against this background, the importance of bringing light into the neural computations that are performed by the DCN neurons can be easily concluded. Studies of the afferent and efferent connections of the DCN have been numerous during the past, (Batini et al., 1992, De Zeeuw et al., 1995, Teune et al., 1998, Pedroarena et al., 2003) but still very little is known about the electrical membrane properties of the DCN neurons themselves. Morphologically, three classes of DCN neurons have been distinguished, based on their different projection targets and content of neurotransmitters (Teune et al., 1998, Schwarz and Schmitz, 1997, Sultan et al., 2001). Despite the extensive knowledge on the anatomical properties of these different types of neurons, it is not known whether the morphologically defined cell types find their correlate in different electrophysiological characteristics and few attempts have been made to correlate electrophysiological and anatomical measures (Czubayko et al., 2001). The present study tries to differentiate functional groups of cells based on their intracellular properties and to relate them to anatomical features. A second focus was set on electrophysiological investigations of the role of glycine in the inhibitory synaptic transmission of the DCN neurons. By means of patch clamp recordings the existence of glycinergic receptors and synapses in DCNs from juvenile and young adult rats (P13 to P23) was investigated. It could be shown that exogenously applied glycine gated in all tested DCNs chloride sensitive currents that could be blocked by nanomolar concentrations of the glycine antagonist, strychnine. These results indicate that DCNs express functional inhibitory glycine receptors throughout the whole explored period. In contrast, glycinergic IPSCs were detected exclusively in DCNs from rats older than P17. Confirming previous experiments it could be shown that all spontaneous IPSCs could be blocked by low doses of GABAA receptor blockers (bicuculline 3µM or gabazine 200 nM). However under conditions of increased spontaneous synaptic activity (by application of 4-aminipyridine, 250 µM and/or TEA 2.5 mM) IPSCs sensitive to strychnine were detected, but only in recordings from P18 or older rats. Furthermore, application of hypertonic solutions (a procedure that elicit vesicular release), or putative focal stimulation of terminals apposed to DCNs, failed to elicit glycinergic IPSCs in DCNs from rats P13-P17. Since glycinergic synaptic currents can be elicited in neonatal DCNs (Kawa 2003) this data indicates that a functional gap occurs at glycinergic DCN synapses during the juvenile age. These results are suggestive that silent synapses might represent a constitutive state during the postnatal maturation of glycinergic synapses in general and raises the possibility that a number of those remain silent during adulthood constituting a reserve pool.