Apoptose von respiratorischen Epithelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer Keim, der zu den häufigsten Erregern nosokomialer Pneumonien zählt. Besonders anfällig für eine P. aeruginosa-Pneumonie sind beatmete Patienten. Für dieses Patientenkollektiv ist P. aeruginosa der am häufigsten isolierte Erreger, aufgrund dessen ist die Entwicklung neuer Präventions- und Therapiemaßnahmen von großer Bedeutung. Der ubiquitär vorkommende Keim P. aeruginosa ist in ständigem Kontakt mit gesunden Keimträgern, die jedoch nicht an einer Infektion erkranken. Das Verständnis über die Clearence von P. aeruginosa aus der Lunge gesunder Individuen könnte zu neuen Möglichkeiten führen, den Wirtsorganismus bei der Elimination von P. aeruginosa aus dem Respirationstrakt therapeutisch zu unterstützen. Bei der Abwehr gegen P. aeruginosa spielt der Chloridkanal CFTR an der Oberfläche respiratorischer Epithelzellen als spezifischer Rezeptor für das P. aeruginosa-Lipopolysaccharid (LPS) eine wichtige Rolle: deren Interaktion vermittelt die - für die Elimination des Keims entscheidende Voraussetzung - endozytotische Aufnahme des Bakteriums in die Wirtszelle. Bei Patienten der monogen erblichen Erkrankung Zystische Fibrose (ZF) führt eine Mutation des CFTR – Gens und damit gestörte Internalisierung von P. aeruginosa zu einer mangelnden Keimclearence, so das dieses Patientenkollektiv chronische Infektionen durch P. aeruginosa entwickelt. Die Internalisierung von P. aeruginosa muss eine bisher nicht im Detail geklärte Signalkaskade in Gang setzen, an deren Ende die Elimination von P. aeruginosa aus dem Respirationstrakt steht. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Apoptoseinduktion durch P. aeruginosa durch eine spezifische P. aeruginosa-LPS – CFTR Interaktion ausgelöst und über welchen Signaltransduktionsweg diese vermittelt wird. Daran sollte abgeleitet werden, welche Rolle die Apoptose bei der Verhinderung von respiratorischen Infektionen durch P. aeruginosa spielt. Mit einem in - vitro Modell von respiratorischen Epithelzellen, die sich durch die Expression von wildtyp CFTR und delta-F508 CFTR (ein mutiertes Molekül, das P. aeruginosa-LPS nicht binden und internalisieren kann) unterschieden, konnten die Apoptosefrequenzen abhängig von der CFTR Expression flusszytometrisch gemessen werden. Es wurden Untersuchungsreihen mit unterschiedlichen Apoptose induzierenden Stimulantien durchgeführt. Isoliertes P. aeruginosa-LPS konnte durch Interaktion mit wildtyp CFTR sowohl bei konfluenten als auch polaritätslosen Epithelzellen keine Apoptose induzieren, wohingegen die Infektion mit dem vollständigen Bakterium in allen untersuchten Zelllinien zeit– und dosisabhängig Apoptose auslöste. Die Variation der CFTR Expression führte – selbst bei aufgrund eines LPS-Defektes nicht via CFTR internalisierbaren P. aeruginosa Stämmen - zu keinen wesentlichen Unterschieden in der Apoptosefrequenz. Bei allen untersuchten respiratorischen Epithelzellen fand eine zeitabhängige Aktivierung der Initiatorcaspase – 8 und der Effektorcaspase – 3 statt. Zur Determination des Signaltransduktionswegs der Apoptose durch P. aeruginosa wurde die Apoptosefrequenz von Jurkat-Zelllinien nach Infektion mit P. aeruginosa flusszytometrisch bestimmt: der intrinsische Signalweg war für die Apoptoseinduktion durch P. aeruginosa entscheidend, wohingegen der extrinsische Weg nicht erforderlich war. CFTR ist nicht an der Signaltransduktion für Apoptose in respiratorischen Epithelzellen beteiligt, da das P. aeruginosa-LPS - obwohl es mit CFTR interagiert und internalisiert wird - keine Apoptose in diesen Zellen induzierte. Die Apoptoseinduktion durch P. aeruginosa in respiratorischen Epithelzellen wurde weder durch die Internalisierung von P. aeruginosa LPS noch durch das gesamte Bakterium moduliert. Daher scheint die Apoptoseinduktion ein von der Internalisierung von P. aeruginosa beziehungsweise P. aeruginosa-LPS abgekoppelter Prozess zu sein. Der Signaltransduktionsweg der Apoptoseinduktion durch P. aeruginosa scheint über keine Verbindungen zum dem Transduktionsweg zu verfügen, der die Internalisierung von P. aeruginosa in respiratorische Epithelzellen über CFTR vermittelt.

The opportunistic bacterium Pseudomonas aeruginosa appertains to the most frequent pathogens of nosocomial pneumonia. Artificially ventilated patients are particularly susceptible to P. aeruginosa induced pneumonia. Within that collective, P. aeruginosa is the most frequently isolated pathogen and therefore development of new preventive and therapeutic measures is of primary importance. Although incessantly exposed to ubiquitarily existing pathogen P. aeruginosa, healthy persons do no come down with infections. Insight into pulmonary clearance mechanisms of P. aeruginosa in healthy individuals could lead to new therapeutic possibilities to support organism in elimination of P. aeruginosa in respiratory tract. Chloride ion-channel CFTR in respiratory epithelial layer plays a decisive role in defence of P. aeruginosa by acting as a specific receptor for P. aeruginosa –lipopolysaccharide (LPS): their interaction is a prerequisite for endocytotic incorporation of P. aeruginosa into the respiratory cell. A Mutation of CFTR gene of patients suffering from cystic fibrosis leads to a lack of pathogen elimination and consecutive chronic infections with P. aeruginosa due to disordered internalisation of P. aeruginosa. Internalisation of P. aeruginosa has to start up a not entirely known signaling cascade which results in elimination of P. aeruginosa from respiratory tract. Aim of this study was to examine whether induction of apoptosis by P. aeruginosa is mediated via specific P. aeruginosa-LPS-CFTR interaction and which pathway is used for induction of apoptosis. Denotation of apoptosis in prevention of respiratory infections should be deduced from these conclusions. Dependency of frequency of apoptosis on expression of CFTR was measured flow cytometrically by using an in-vitro model of respiratory epithelial cells which are distinguishable from expression of wild type CFTR and delta-F508 CFTR (mutated molecule which is not able to bind and internalise P.aeruginosa-LPS), respectively. A set of experiments was done with various stimulants inducing apoptosis. Apoptosis could not be induced by interaction of isolated P. aeruginosa-LPS with wild type CFTR both at confluent and epithelial cells having no polarity, whereas infection of all tested cell lines with entire bacterium induced time and dose-dependent apoptosis. No major difference in frequency of apoptosis could be observed by variation of CFTR expression even at P. aeruginosa strains, which cannot be internalised via CFTR due to defective LPS. Time-dependent activation of initiator caspase 8 and effector caspase 3 occurred in all examined respiratory epithelial cells. Frequency of apoptosis of Jurkat cell lines was measured flow cytometrically after infection with P. aeruginosa in order to determine which pathway is used for induction of apoptosis by P. aeruginosa. Extrinsic pathway was dispensable whereas intrinsic pathway was essential for induction of apoptosis by P. aeruginosa. Because P. aeruginosa-LPS did not induce apoptosis in respiratory epithelial cells although it was internalized after interaction with CFTR, CFTR is not involved in signal transduction of apoptosis in these cells. In respiratory epithelial cells, induction of apoptosis by P. aeruginosa was not modulated by internalisation of neither P. aeruginosa-LPS nor bacterium on the whole. Therefore induction of apoptosis seems to be uncoupled from internalisation of P. aeruginosa and P. aeruginosa-LPS, respectively. Signal transduction of induction of apoptosis by P. aeruginosa seems to have no crosslink to the pathway which mediates internalisation of P. aeruginosa in respiratory epithelial cells. Activation of CFTR is likely neither depressant nor strengthening concerning outcome of apoptosis in respiratory epithelial cells. As a conclusion, induction of apoptosis of P. aeruginosa in present cell model is not mediated by activation of CFTR. Expression of wild type CFTR does not affect induction of apoptosis. Therefore internalisation of P. aeruginosa is likely independent from induction of apoptosis. Although cystic fibrosis as an elimination model speaks for a specific interaction between bacterium and CFTR during elimination of the pathogen, interaction was not essential for induction of apoptosis. Therefore apoptosis can likely not be considered for specific elimination of P. aeruginosa out of respiratory tract.