Untersuchungen zur Expression des c-kit-Rezeptors bei der Entstehung und Progression des malignen Melanoms

Abstract

Der c-kit-Rezeptor spielt einerseits eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Differenzierung einer ganzen Reihe von Zellen, unter anderem von Melanozyten, und ist an Signalkaskaden beteiligt, die zum Zellüberleben beitragen, andererseits ist er aber auch bei diversen Tumoren als Protoonkogen bekannt. Darüberhinaus reguliert c-kit jedoch auch Signaltransduktionswege, die bei Melanomzellen in Anwesenheit seines Liganden SCF zur Apoptose führen. Über seine Rolle bei der Entstehung sowie bei der Progression des malignen Melanoms liegen bislang noch ungenügende Daten vor und so zeigt sich letztlich ein recht uneinheitliches Bild über seine Funktion. In bislang verfügbaren Arbeiten über c-kit wurde der Schwerpunkt größtenteils auf einzelne Funktionen von c-kit gelegt oder es wurde nur eine kleine Anzahl an unterschiedlichen Tumorzellinien untersucht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Erstellung eines umfassenden Expressionsprofils von c-kit. Die c-kit-Expression wurde einerseits durch die Untersuchung einer Vielfalt an Zellinien, die von Melanozyten über Nävi, RGP- und VGP-Melanome hinweg bis hin zu Melanommetastasen und einigen anderen Tumorzellinien sowie Nativgeweben reichte, analysiert. Andererseits wurde die Expressionsuntersuchung der Zellinien auf verschiedenen Expressionsstufen des Rezeptors, das heißt auf RNA-, DNA- und Proteinebene, durchgeführt. Hierzu wurden die Methoden des Northern Blottings, der PCR, des Western Blottings, der FACS-Analyse sowie der Immunhistologie angewandt. Vor dem Hintergrund der bislang verfügbaren Daten sollte anhand dieser Zellinien- und Methodenvielfalt untersucht werden, ob ein Zusammenhang zwischen der c-kit-Expression und der Progression des malignen Melanoms hergestellt werden kann. Von zentralem Interesse war hier die Frage, ob und zu welchem Zeitpunkt der Melanomprogression die Expression von c-kit verloren geht. In der vorliegenden Arbeit konnte durch die zellbiologische Methode der FACS-Analyse in 82,84% der Melanozyten eine c-kit-Rezeptorexpression nachgewiesen werden, während die Nävuszellen, alle Melanom- sowie alle Tumorzellen negativ für c-kit waren. Mit Hilfe der proteinchemischen Methode des Western Blots zeigten sich neben den Melanozyten zusätzlich Nävuszellen positiv für den Rezeptor, während die Melanom- sowie die anderen Tumorzellinien c-kit-negativ waren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Expression des c-kit-Proteins schon zu einem sehr frühen Zeitpunkt der Melanomprogression nicht mehr stattfindet. In den immunhistologischen Untersuchungen an mehreren Nävi, superfiziell spreitenden Melanomen, einem Lentigo Maligna Melanom sowie einigen Hautmetastasen konnten die Ergebnisse des Western Blots bestätigt werden. Darüberhinaus zeigt sich anhand der Färbung eines superfiziell spreitenden Melanoms, daß die c-kit-Rezeptorexpression negativ mit dem Invasionspotential von Melanomzellen korreliert. Während hier eine deutliche Färbung der Tumorzellen an der Junktionszone auf eine c-kit-Expression hinweist, ist mit zunehmender Invasionstiefe des Melanoms jedoch eine abnehmende Anfärbung der Tumorzellen zu erkennen, in der tiefen Dermis geht die c-kit-Expression sogar gänzlich verloren. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, daß durch den Expressionsverlust von c-kit die Invasionsfähigkeit der Melanomzellen ansteigt. Das Lentigo Maligna Melanom sowie die Färbung einer Melanomhautmetastase waren negativ für c-kit. Mit Hilfe der Methode der PCR konnte ein Teilfragment von c-kit einmalig erfolgreich amplifiziert werden, alle weiteren PCR-Reaktionen zur Amplifikation von c-kit waren negativ. Ebenso waren im Northern Blot alle Melanom- sowie Tumorzellen negativ für c-kit. Insgesamt zeichnete sich über alle in der vorliegenden Arbeit angewandten Methoden hinweg die Tendenz ab, daß die Expression des c-kit-Rezeptors mit fortschreitender Progression des malignen Melanoms herunterreguliert wird. Die Ergebnisse in der vorliegenden Arbeit lieferten Hinweise, daß dieser Expressionsverlust stattfindet, wenn die Tumorzellen ihr Invasionspotential in die Dermis erlangen. Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß eine negative Korrelation zwischen der Progression des malignen Melanoms und der c-kit-Rezeptor-Expression gefunden werden konnte.

On the one hand, c-kit receptor plays an important role in the development and differentiation of several cells, amongst others of melanocytes, and is involved in signaling pathways contributing to cell survival, on the other hand c-kit is also known as proto oncogene in several tumours. Furthermore, c-kit regulates pathways leading to apoptosis in melanoma cells if c-kit ligand SCF is present. Up to now, as far as malignant melanoma is concerned only inconsistent data exists about the role of c-kit in development and progression of melanoma. Previous studies either focused on particular functions of c-kit or investigated only a small number of different tumour cell lines. The aim of the present study was to create an extensive expression analysis of c-kit. For this purpose, c-kit expression was analysed on a variety of cell lines ranging from melanocytes to nevi, radial growth phase (RGP) and vertical growth phase (VGP) melanomas to melanoma metastases and finally numerous different tumour cell lines as well as native tissues. The expression analysis was carried out on different levels of c-kit receptor expression i.e. on RNA, DNA and protein level by northern blotting, PCR, western blotting, FACS analysis and immunohistochemistry. The main question was to find out if c-kit expression is downregulated during melanoma progression and if so, at which point. In this study, FACS analysis showed c-kit receptor expression in 82,84% of melanocytes whereas nevus cells, all melanoma cell lines and all other tumour cell lines were negative for c-kit. Western blot analysis showed c-kit receptor positivity for melanocytes and an additional c-kit receptor positivity in nevus cells whereas all melanoma and other tumour cell lines were c-kit negative. These results indicate that c-kit protein expression is lost at a very early point in melanoma progression. Immunohistochemistry on several nevi, superficially spreading melanomas, one lentigo maligna melanoma as well as several skin metastases confirmed the results obtained by western blot analysis. Furthermore, staining of a superficially spreading melanoma showed negative correlation between c-kit receptor expression and invasion potential of melanoma cells: while there was an obvious c-kit staining of tumour cells in the junction zone, staining diminished with increasing melanoma invasion level and was completely absent in the deep dermis. This could indicate that invasion potential of melanoma cells increases with loss of c-kit expression. Accordingly, lentigo maligna melanoma and skin metastases were all negative for c-kit. In PCR, except for the successful amplification of one fragment of c-kit, all amplifications of c-kit were negative. Northern blotting results were also c-kit negative for all tested melanoma and tumour cell lines. All in all, the present study shows a tendancy of downregulation of c-kit receptor expression during progression of malignant melanoma in all applied methods. Moreover, the results of this study indicate that this loss of expression occurs when tumour cells gain invasion potential into the dermis. Taken together, a negative correlation between progression of malignant melanoma an c-kit receptor expression was found.