Cellular transport and binding proteins of oligonucleotides and small-interfering RNA in microglial cells

Abstract

Microglia are the major component of the cellular immune system in the central nervous system. Microglial cells are involved in almost all neuropathological processes and are therefore considered prime targets for gene therapy. With the knowledge of nucleic acids and gene regulation growing a class of new clinically relevant drugs, therapeutic nucleic acids, are rapidly developed. But poor in-vivo stability, low permeability and potential unspecific effects are big obstacles for potential therapeutic applications. Understanding of cellular uptake, transport and potential unwanted effects of therapeutic nucleic acids in microglia is thus important for applications in central nervous system diseases. Our data support a receptor-mediated uptake mechanism for single-stranded oligonucleotides (ODN) (Chapter 2) and small interfering RNA (siRNA) (Chapter 5) in microglia because cellular uptake is dose-, time-, temperature-, modification-, and energy-dependent and inside cells they mainly localize to the cytoplasm with spot pattern. Further unmodified siRNA was showed to co-localize with endosomes after uptake. Cellular uptake is the prerequisite for the activity of most therapeutic nucleic acids. Increasing uptake might be a good way to enhance the efficiency of therapeutic nucleic acids. Here we provide evidence that a 3'-end polyG motif can enhance phosphodiester (PE) CpG-ODN uptake resulting into increased immunomodulatory activity in microglial cells (Chapter 3). Such effects are dependent on the location of the polyG motif and the backbone modification of ODN. Inside cells, nucleic acids have the potential to sequence-unspecifically interact with certain cellular proteins (Chapter 2, 3 and 5). Such interactions are strongly backbone-modification dependent and to a much lesser degree of sequence dependent. Most ODN binding-proteins are RNA or DNA binding proteins, which are important for chromosome organization, transcription regulation and RNA processing. The sequence-unspecific interaction of nucleic acids with cellular binding proteins might influence the physiological function of these proteins. We observed that siRNA could bind to PKR and trigger enzymatic activity. In addition the binding proteins might affect intracellular nucleic acid distribution. Three membrane proteins were identified as ODN binding-proteins that indicated they might be involved in nucleic acid uptake. We observed that peripheral application of nucleic acids could have unwanted effects on the central nervous system. In Chapter 6, it is shown that a significant but transient increase of activated microglia was induced in rat spinal cord after peripheral administration of immunostimulatory nucleic acides, poly (I:C) and R848. Our findings will contribute to rational design and evaluation of nucleic acid-based therapeutic strategies.

Mikrogliazellen bilden die Hauptkomponente des zellulären Immunsystems im Zentralen Nervensystem. Mikrogliazellen sind an fast allen neuropathologischen Prozessen beteiligt and sind deshalb ausgezeichnete Kandidaten für gentherapeutische Ansätze. Durch den enormen Wissenszuwachs in den Forschungsbeiten Nukleinsäuren und Genregulation tritt eine Klasse von klinisch relevanten Pharmaka, therapeutisch einsetzbare Oligonukleotide (ODN), immer wieder in den Vordergrund. Aber die unzureichende in-vivo Stabilität, geringe Permeabilität und potenzielle unspezifische Wirkungen bilden nicht unerhebliche Hürden auf dem Weg einer zukünftigen Anwendung. Das Verständnis der zellulären Aufnahme, des Transportes und potenzieller unerwünschter Wirkungen therapeutischer ODN auf Mikrogliazellen ist deshalb wichtig für eine Verwendung bei Erkrankungen des Zentralen Nervensystems. Unsere Daten sind vereinbar mit einem Rezeptor-mediierten Aufnahmemechanismus für einzelsträngige Oligonukleotide und siRNA (small interfering RNA) in Mikrogliazellen. Drei Membranproteine wurden identifiziert, die an der Aufnahme von ODN beteiligt sein könnten. Die Oligonukleotidaufnahme ist dosis-, temperatur-, energie- und modifikationsabhängig und innerhalb der Zellen finden sich die Oligonukleotide innerhalb des Zytoplasma in granulären Strukturen. Eine Lokalisation von siRNA in Endosomen wurde nachgewiesen. Eine zelluläre Aufnahme ist eine Vorbedingung für die Aktivität der meisten therapeutischen Nukleinsäuren. Eine Verbesserung der Aufnahme könnte deshalb die Wirkungseffizienz verbessern. Wir beobachteten, dass ein polyG-Motif am 3'-Ende die Aufnahme von phosphodiester (PE)-ODN erhöht und die immunmodulatorische Wirkung von CPG-ODN verstärkt. Innerhalb der Zellen können therapeutische ODN potenziell mit Proteinen interagieren. Diese Interaktionen hängen auch stark von der Art der Oligonukleotidmodifikation ab. Die meisten ODN-bindenden Proteine sind RNA- oder DNA-bindende Proteine, die eine Rolle in der Chromosomenorganisation, der Regulation der Transkription und der RNA Prozessierung spielen. Die sequenzunabhängige Interaktion von ODN mit zellulären Proteinen könnte die physiologische Funktion dieser Proteine stören. So beobachteten wir z.B., dass siRNA an PKR bindet und die enzymatische Aktivierung induziert. Weiterhin könnte die Bindung an zelluläre Proteine die intrazelluläre Verteilung der ODN entscheidend bestimmen. Weiterhin konnten wir nachweisen, dass in-vivo noch unerwartete Wirkungen von ODN zu beobachten sind. So wurde von uns nach systemischer Gabe von Poly-I,C eine Mikrogliaaktivierung im Rückenmark der Ratte und eine Proliferation von Stammzellen beobachtet.