Vergleich verschiedener Testprinzipien zur Diagnostik und Therapiesteuerung der HCMV-Infektion bei Patienten nach allogener Stammzellentransplantation

Abstract

In der Diagnostik der primären und reaktivierten Humanen Cytomegalievirus (HCMV)-Infektion hat sich die quantitative PCR als geeignete Methode erwiesen. Sie zeigt deutliche Vorteile bezüglich der Bestimmung der Schwere einer Infektion, der Vorhersage des Erkrankungsrisikos und eignet sich zum Monitoring der präemptiven antiviralen Therapie. Ziel dieser Arbeit war die Evaluation einer sensitiven, schnellen und kostengünstigen quantitativen PCR-Analyse mittels LightCycler (LC). Verglichen wurde eine neuentwickelte LightCycler-PCR (LC A) mit dem kommerziell erhältlichen quantitativen Cobas CMV Monitor (CMM), der qualitativen In-House PCR und einer früher publizierten LightCycler-PCR (LC B) (Schaade et al., 2000). Der LC A amplifiziert die 146 bp Region des 4. Exon auf dem HCMV-immediate early Gen, während der LC B eine definierte Region des Gylcoprotein B Gens erkennt.

Insgesamt wurden 45 Patienten (392 Blutproben) nach myeloablativer Therapie und anschliessender allogener Stammzell- bzw. Knochenmarkstransplantation zunächst parallel im konventionellen quantitativen CMM, der spezifisch das DNA-Polymerase-Gen des HCMV amplifiziert und in einer qualitativen PCR (In-House PCR) analysiert. Anschliessend wurden alle HCMV-positive (n=64) und 36 ausgewählte negative (n=36) Proben im LC A und im LC B analysiert.

Die neuentwickelte LC-Analyse (LC A) zeigte eine Sensitivität von 250 Genomäquivalente (GE) und war im dynamischen Messbereich zwischen 250 und 2,5x105 GE linear. Im Vergleich waren von den 64 CMV positiv getesteten Blutproben 44 Proben im LC A und 48 Proben im LC B positiv. Die analysierte Viruslast befand sich für CMM zwischen 400 GE bis 2,1x105 GE, für LC A zwischen 250 GE und 6,9x105 GE und für LC B zwischen 250 GE bis 5,4x105 GE. Der Median für die gemessene Viruslast war 5990 GE für CMM, 1199 GE für LC A und 2100 GE für LC B. Im Patientenvergleich konnte zwischen LC A und CMM eine Korrelation von 96,4% festgestellt werden. 24 von 25 im CMM HCMV-positive Patienten wurden auch im LC A als positiv identifiziert. Keine der Nachweismethoden zeigte ein virämisches Ereignis signifikant früher an oder wurde unter antiviraler Therapie signifikant früher negativ.

Der LC eignet sich zur Initiierung und Steuerung einer präemptiven antiviralen Therapie bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation. Die neue LC Methode (LCA) bietet eine schnelle, sensitive, kostengünstige und bedienerfreundliche Analysemöglichkeit. Jedoch zeigte der LC A, verglichen mit der qualitativen In-House PCR und der quantitativen CMM eine signifikant niedrigere Sensitivität.

For diagnosis of primary and reactivated cytomegalovirus (CMV) infection, quantitative PCR assays has been shown to be a valuable tool determing the severity of an infection, predicting the risk of a patient developing disease and monitoring preemptive antiviral therapy. The aim of this study was to develop a sensitive, rapid and inexpensive quantitatve PCR using the LightCycler and to compare the quantification of CMV-DNA in human blood assessed with this test to the results obtained with a previously described LightCycler assay (Schaade et al., 2000), the commercially available COBAS Amplicor CMV Monitor test (CMM) and a qualitative CMV-PCR (in-house PCR).

Methods At first 392 samples extracted from blood of 45 patients after allogenic bone marrow transplantation were tested in a qualitative CMV-PCR (in-house PCR) and the quantiative PCR performed on a prospective routine basis (CMM), amplifying the DNA polymerase gene of CMV. Based on the results CMV positive (n=64) and –negative DNA samples (n=36) were randomly selected. After that each sample was quantified by a newly developed LightCycler-PCR, amplifying a 146 bp region of the 4th exon of the CMV-immediate early 1 gene (LC A) and compared to a LightCycler assay amplifying a defined region on the glycoproteine B gene (LC B).

Results The newly developed LightCycler assay (LC A) showed a sensitivity of 250 genome equivalents (GE) and a linearity between 250 und 2,5x105 GE. Comparing 64 samples which were CMV positive 44 samples were also positive by LC A and 48 by LC B. The viral load detected by LC A ranged from 250 GE to 6,9x105 GE, by LC B from 250 GE to 5,4x105 GE and by CMM from 400 GE to 2,1x105 GE. The median CMV load was 1199 GE in LC A, 2100 GE in LC B and 5990 GE in CMM. Comparing the 25 patinets which were CMV positive in CMM, 24 were also positive by LC A.

Conclusion This new LightCycler (LC A) assay offers a rapid, sensitive and cost-effective tool for the quantification of the CMV load in blood of patients after allogenic bone marrow transplantation. However, compared to a semi-quantitative in-house PCR and to COBAS Amplicor CMV Monitor, the new LightCycler assay (LC A) showed a significantly lower sensitivity.