Passive und aktive Immunisierung gegen Enterokokken-Aggregationssubstanz: Testung der protektiven Wirkung in murinen Infektionsmodellen

Abstract

Hintergrund: Nosokomial erworbene Enterokokken-Infektionen sind eine zunehmende Bedrohung für Intensivpatienten und immunsupprimierte Patienten. Die Letalität von Enterokokken-Bakteriämien wird mit über 40 % beziffert und die Therapie–Optionen sind insbesondere bei multiresistenten Enterokokken deutlich eingeschränkt. Die Zunahme multiresistenter Enterokokkenstämme erfordert ein Umdenken und das Erarbeiten möglicher Alternativen. Das Enterokokken-Oberflächenprotein Aggregation Substance (AS) vermittelt den Transfer von (Resistenz-) Plasmiden und wurde als Virulenzfaktor identifiziert. Wir haben ein Tiermodell erarbeitet und untersucht, ob Antikörper gegen AS einen therapeutischen Benefit erbringen könnten. Methoden: Immunes Kaninchenserum (IRS) wurde mit nativem Kaninchenserum (NRS) und mit einer NaCl-Kontrollgruppe im Maus-Sepsis-Modell auf protektive Effekte verglichen. Als Erfolgskontrolle überprüften wir die Mäuseseren auf Antikörpertiter im ELISA. Infiziert wurde mit den E.-faecalis-Mutanten INY3000 pINY1801 (AS-positiv) und INY3000 pWM401 (AS-negativ, ansonsten genetisch identisch). Weiterhin führten wir aktive Immunisierungen gegen AS durch. Verglichen wurde hier mit Kontrollgruppen die mit Rinderalbumin (BSA) immunisiert worden waren, sowie eine NaCl-Gruppe. Ergebnisse: In Vorversuchen wurde zunächst sichergestellt, dass die unterschiedlichen E.-faecalis-Mutanten sich in vergleichbarem Maße in den Organen absiedeln, und dass keine Störfaktoren, wie ein Absterben der Bakterien durch wiederholtes Einfrieren oder Klumpungsreaktionen zu erwarten waren. Alle Mäuse der Verum-Gruppe hatten IgG-Kaninchenantikörpertiter gegen AS im Mittel von 1:20000 +/- 8000. Nach Infektion der Mäuse mit 6,4 x 107 bis 1,8 x 109 Enterokokken der AS-positiven E.-faecalis-Mutante, war der Gewichtsverlust der Mäuse der IRS-Gruppe signifikant niedriger (97,9+/-3,6 %, in Prozent des Ausgangsgewichtes +/- MW, n=35) gegenüber den Kontrollgruppen (NRS 95,3+/-2,9 %, p=0,0364, NaCl 93,3+/-3,3 %, p=0,0004, ANOVA, je n=35). Die Anzahl der Enterokokken in den Nieren der IRS-Gruppe war signifikant niedriger als in der NRS-Gruppe (p=0,0331, ANOVA). Bei passiver Immunisierung und Infektion mit der AS-negativen E.-faecalis-Mutante ließen sich keine signifikanten Unterschiede feststellen. Bei den aktiven Immunisierungen hatten die Mäuse IgG-Antikörpertiter gegen AS im Mittel von 1:150000 +/-190000. Eine signifikante Reduktion der Anzahl der Enterokokken in den Nieren der immunisierten Tiere gegenüber der NaCl-Kontrollgruppe wurde hier beobachtet (p=0,05, ANOVA, je n=30 ). Der Gewichtsverlust unterschied sich nicht signifikant voneinander. Schlussfolgerung: Antiseren gegen AS zeigen protektive Effekte in unserem Maus-Sepsis-Modell. Unsere Ergebnisse deuten auf eine mögliche Ergänzung zu medikamentös-antibiotischen Therapien als adjuvante Immuntherapie in der Prävention und der Therapie von schweren Enterokokkenseptikämien hin.

Background: Nosocomial infections of enterococci are an increasing threat for ICU patients and immunocompromised patients. The mortality of enterococcal sepsis was described previously more than 40 % and treatment is often difficult due to multiple antibiotic resistance amongst enterococci. The increasing occurence of multidrug-resistant enterococcal strains requires a change of view and the development of possible alternatives. The enterococcal surface protein Aggregation Substance (AS) mediates a transfer of (resistance-) plasmids and was identified as a virulence factor. We developed an animal-model and examined whether antibodies against AS could have a therapeutic benefit. Methods: The protective effect of immune rabbit serum (IRS) was compared to native rabbit sera (NRS) and a saline control group in a mouse sepsis model. As control of success we checked the mice sera for antibody titers, using an ELISA. Infection was performed with mutants of E. faecalis INY3000 pINY1801 (AS positive) and INY3000 pWM401 (AS negative, otherwise genetically identic). Then we performed active immunizations against AS. We compared this group to a control group receiving bovine serum albumine (BSA) intravenously, and a saline control group. Results: In the first trials we made sure that the different mutants of E. faecalis grew to the same degree in the different organs of mice in all groups, and that there were no interfering factors like the killing of bacteria by repeated freezing or by clumping reactions. All mice of the IRS group had a mean of IgG antibody titer against AS of 1:20000 +/- 8000. After the infection of mice with 6,4 x 107 to 1,8 x 109 enterococci of the AS positive mutant of E. faecalis, weight loss of mice in the IRS group was significantly lower (97,9+/-3,6 %, in percent of the initial weight +/- mean, n=35) than in the other groups (NRS 95,3+/-2,9 %, p=0,0364, saline 93,3+/-3,3 %, p=0,0004, ANOVA, n=35 each). The number of enterococci in the kidneys of the IRS group was significantly lower than in the NRS group (p=0,0331, ANOVA). When passively immunized and infected with the AS negative mutant of E. faecalis, no significant differences could be detected. When actively immunized, a mean of IgG antibody titers against AS of 1:150000 +/- 190000 was detected. Here, we observed a significant reduction of enterococci in the kidneys of the immunized animals in comparison to the saline group (p=0,05, ANOVA, n=30 each). Weight loss was not different significantly. Conclusion: Antisera against AS show a protective effect in our mouse sepsis model. Our results point to the possibility of an addition to antibiotic treatment, as an adjuvant immunotherapy in the prevention and therapy of severe enterococcal sepsis.