Generierung nicht-alloreaktiver T-Zellen durch Methotrexat, AICD (activation induced cell death) und immunomagnetische Depletion zur Immuntherapie nach Stammzelltransplantation

Abstract

Der adoptive Transfer von T-Zellen von allogenen Spendern ist aufgrund der Entstehung einer Graft-versus Host Erkrankung eingeschränkt. Die Depletion alloreaktiver T-Lymphozyten zur Immuntherapie ist ein wesentlicher Ansatz zur Prävention einer Graft-versus Host Erkrankung. Des Weiteren verhindert die Generierung immunkompetenter nicht-alloreaktiver T-Zellen eine Immunschwäche in einem frühen Stadium nach der Transplantation. Alloreaktive T-Zellen wurden in einer modifizierten Lymphozytenmischkultur (MLC) aktiviert. Hierfür verwendeten wir durch INFg und TNFa aktivierte Stimulatorzellen. Im Anschluss wurde dieser MLC eine geringe Konzentration des Folsäure- Antagonisten Methotrexat (10mmol) zugeführt. Später kultivierten wir die Lymphozytenmischkultur in frischem Medium unter Zusatz von Folsäure. Hierbei konnten wir demonstrieren, dass MTX die Apoptose in in-vitro allo-aktivierten T-Zellen von humanem peripheren Blut induziert. Die Apoptose ließ sich fast vollständig durch die Zugabe von Folsäure verhindern. Die Depletion alloreaktiver T-Zellen durch MTX in der Gegenwart von Folsäure konnte ebenfalls in einer sekundären MLC aufgezeigt werden, wobei der Thymidineinbau in die DNA der alloreaktiven T-Zellen unter Stimulation mit den ursprünglichen Stimulatorzellen suffizient reduziert werden konnte. Es zeigte sich dabei außerdem eine moderate Reaktivität gegenüber "third party"-Zellen, PHA und Tetanus Toxoid. In einem Zytotoxizitätsessay demonstrierten wir, dass die Fähigkeit zytotoxischer T-Zellen zur Zellyse unterbunden werden konnte, während die zytotoxische Reaktivität gegenüber "third party" Zielzellen aufrechterhalten wurde. Es gelang uns eine weitere Methode zu entwickeln, die es ermöglichte selektiv alloreaktive T-Zellen durch den CD95/CD95L-vermittelten aktivierten Zelltod (AICD) zu eliminieren. Alloreaktive T-Zellen wurden hierfür unter denselben Bedingungen kultiviert wie zuvor beschrieben. Zusätzlich wurde ein monoklonaler Antikörper sowie IL-2 hinzugefügt. Es ließ sich eine beträchtliche Abnahme von beinahe 80% der Wachstumsrate aktivierter alloreaktiver T-Zellen erzielen. Die übrigen T-Zellen erholten sich gut und reagierten zufriedenstellend auf "third party"- Zellen, PHA und Tetanus Toxoid. Des Weiteren konnte die Zellyse der zytotoxischen alloreaktiven T-Zellen stark reduziert werden, gleichfalls blieb die spezifische Zytotoxizität gegenüber "third party" Zielzellen erhalten. Die bei weitem effektivste Depletion alloreaktiver T-Zellen wurde durch die immunomagnetische Depletion erreicht, unter Verwendung der MACS Vorrichtung mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen die Oberflächenmarker CD25, CD69 und HLA-DR. Unter der Stimulation mit den ursprünglichen Stimulatorzellen beobachteten wir eine deutliche Verminderung des Thymidineinbaus in der negativen Zellfraktion nach der Depletion. Bedauerlicherweise erholten sich die übrigen T-Zellen nicht ausreichend, was sich in einer äußerst schwachen Proliferationsrate gegenüber "third party" Zellen, PHA und Tetanus Toxoid widerspiegelte. Schlussfolgerung: Alle hier vorgestellten Methoden waren in der Lage, alloreaktive T-Zellen erfolgreich zu eliminieren. Die effizienteste Depletion erfolgte mit Hilfe der immunomagnetischen Depletion. Die aufgezeigten Ergebnisse legen nahe, dass unter allen drei Methoden, nur die Induktion des aktivierten Zelltodes (AICD) in alloreaktiven T-Zellen eine ausreichende Generierung nicht alloreaktiver T-Zellen gewährleistet. Diese immunkompetenten T-Zellen verhindern eine GvHD, unter Wahrung einer antiviralen Reaktion und sind daher zum Einsatz einer Immuntherapie nach haplo-identischer Stammzelltransplantation geeignet.

Adoptive transfer of T-cells from allogeneic donors is limited due to the risk of graft-versus-host disease. The depletion of alloreactive T-Lymphocytes in immunotherapy is an essential tool to prevent Graft-versus-Host-disease. Furthermore generating immunocompetent non-alloreactive T-Lymphocytes is important to prevent immunodeficiency, early after transplantation. Alloreactive T-cells were activated by a modified MLC using INFgamma and TNFalpha activated stimulator cells. Afterward they were exposed to a low dose of the folate antagonist methotrexate (10 µmol) and subsequently cultured in drug-free medium in the presence of folinic acid. We report here, that MTX induced apoptosis of in-vitro allo-activated T-cells from human peripheral blood. Apoptosis was almost completely abrogated by addition of folinic acid. The depletion of alloreactive T-cells by MTX in the presence of folinic acid could be demonstrated in a secondary MLC were Thymidin uptake was sufficiently reduced upon stimulation with originally stimulator cells, while a moderate reactivity against third party cells, PHA and tetanus toxoid could be shown. In a cytotoxic assay, we presented, that the lytic potential of cytotoxic T-cells was diminished, while cytotoxic reactivity against third party target cells was retained. We also explored another possibility of selectively eliminating alloreactive T-cells by the CD95/CD95L-mediated activation induced cell death (AICD). Alloreactive T-cells were therefore activated under the same conditions as previously described and incubated with an agonistic monoclonal antibody (mAb) under co-culture with IL-2. Substantial decrease of almost 80% of proliferative response by activated alloreactive T-cells was achieved. The residual T -cells recovered well and showed specific reactivity against third party cells, PHA and tetanus toxoid. In addition the lytic response by alloreactive T-cells was also highly reduced, whereas specific lysis of third party target cells could be prevented. The most efficient depletion of alloreactive T -cells was achieved by the immuno-magnetic depletion, using the MACS device with monoclonal antibodies against CD25, CD69 and HLA-DR. The Thymidin uptake was strongly reduced in the negative fraction after depletion, upon stimulation with former stimulator cells, unfortunately residual T-cells did not well recover and elicted only a weak proliferative response against third party, PHA and tetanus toxoid. Conclusion: All of the investigated methods demonstrated here were able to eliminate alloreactive T-cells from allogeneic T-cells sufficiently. The most effective depletion was achieved by the immuno-magnetic depletion. The results presented suggest , that of all three methods, only the induction of AICD in alloreactive T-cells could generate a moderate number of non-alloreactive T-cells with an anti-viral activity, suitable for cellular immunotherapy after haplo-identical transplantation, while preventing GvHD.