Einfluss von Phosphatidylserin auf den durch Glycolipidtransferprotein katalysierten Gluco- und Galactocerebrosidtransfer zwischen Liposomen

Abstract

Tierische Zellen sind von einer Plasmamembran umschlossen, die aus einer Lipiddoppelschicht (Bilayer) besteht. Die Matrix dieses Bilayers wird vornehmlich von Phospholipiden (z.B. PS, PC, PE etc.) gebildet, darin eingebettet sind Glycolipide, Cholesterol und Proteine. Die Lipide werden im endoplasmatischen Retikulum und in den Mitochondrien gebildet und von dort zu der Zellmembran transportiert. Dieser Transport wird durch Lipidtransferproteine (z.B. Glycolipidtransferprotein, GLTP) katalysiert. Innerhalb des menschlichen Körpers finden sich die höchsten Konzentrationen an Phosphatidylserin (PS) im Gehirn, mit 15 % am Gesamtlipidanteil. PS wird als das wichtigste saure Phospholipid des Gehirns angesehen. In der vorliegenden Arbeit wird der Einfluss von PS und PE auf den GLTP katalysierten Transfer von Glycolipiden (Gluco- und Galactocerebrosiden) von Donor- auf Akzeptormembranen untersucht. Hierzu werden Liposomen verwendet. Liposomen stellen künstliche Membransysteme dar. Die Liposomen werden mittels Detergenzdialyseverfahren hergestellt. Durch Verwendung verschieden großer Detergentien (Na-Cholat, OG und POE4) können Liposomenreihen unterschiedlicher Größe gewonnen werden. Als Messsystem für den Lipidtransfer werden fluoreszenzmarkierte Lipide – RhodaminB-PE und NBD-Glycolipide (NBD-Glu respektive NBD-Gal) - in die Donorliposomen eingefügt. RhodaminB-PE und NBD-Glycolipide stehen in Resonanz-Energie-Transfer. Die Sensitivität des Messsystems liegt für NBD-Glu bei 93,4 % und für NBD-Gal Donorliposomen bei 95 %. Insgesamt 45 Akzeptorliposomenchargen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung werden hergestellt: reine PC-Liposomen; PC/PS 90/10 bis PC/PS 10/90 und PC/PE 90/10 bis PC/PE 50/50 Liposomen. Aus schlachtfrischen Rinderhirn konnte 487 mg GLTP gewonnen werden. Die Ergebnisse zeigen einen erheblichen Einfluss von PS sowohl auf die Transferraten als auch auf die Größe der Akzeptorliposomen und damit auf die Krümmungsradien der Membrane. Für PE findet sich weder ein signifikanter Einfluss auf die Transferraten noch auf die Größe der Akzeptorliposomen.

Es gilt: • je höher die PS-Konzentration desto kleinere Akzeptorliposomen entstehen, • PS-Konzentrationen von 10 bis 40 % begünstigen den Glycolipidtransfer, • PS-Konzentrationen größer 60 % hemmen den Transfer, • Akzeptorliposomendurchmesser zwischen 120 bis 760 nm begünstigen und • Akzeptorliposomendurchmesser kleiner 100 oder größer 1.000 nm hemmen den GLTP katalysierten Transfer von NBD-Glu und NBD-Gal.

Rechnerisch liegt das Maximum des Transfers für NBD-Glu bei einem PS-Anteil von 20 % und für NBD-Gal bei 22 % PS.

Animal cells are enveloped by plasma membrane consisting of lipid bilayer. The matrix of the bilayer is formed by phospholipids (e.g. PS, PC, PE); glycolipids, cholesterol and proteins are embeded. The Lipids are synthesised in the endoplasmic reticulum and mitochondria and then transported to the cell membrane. This transport is catalysed by lipid transfer proteins (e.g. glycolipid transfer proteins, GLTP). In human body the highest concentration of phosphatidylserine (15 % of the total lipid fraction) is found in the brain. PS is considered the most important acid phospholipid of the brain. In this study the influence of phosphatidylserine (PS) and phosphatidylethanolamine (PE) on the gluco- and galactocerebroside transfer between donor and acceptor liposomes catalysed by GLTP is examined. Therefore liposomes are used. Liposomes are artificial membrane systems. The liposomes are synthesised by detergent dialysis. Using different sized detergents (Na-Cholat, OG und POE4) you get liposomes of different size. To measure the lipid transfer fluorescent marked lipids – RhodaminB-PE and NBD-Glycolipide (NBD-Glu and NBD-Gal) – are embeded into the donor liposomes. RhodaminB-PE and NBD-Glycolipide are in resonant energy transfer. The sensitivity of the measuring system is 93,4 % for NBD-Glu and 95 % for NBD-Gal donor liposomes. A total of 45 charges of acceptor liposomes of different lipid composition are synthesised: pure PC-liposomes; PC/PS 90/10 up to PC/PS 10/90 and PC/PE 90/10 up to PC/PE 50/50 liposomes. 487 mg of GLTP are extracted out of recent butchered bovine brain. The results show an obvious influence of PS both on the lipid transfer rates and on the size of the acceptor liposomes and thereby on the radius of curvature of the membranes. PE has no significant influence neighter on transfer rate nor on size of acceptor liposomes.

Results: • the higher the PS concentration the smaller the generated acceptor liposomes, • PS concentrations from 10 up to 40 % promote the glycolipid transfer, • PS concentrations higher than 60 % inhibit the transfer, • diameter of the acceptor liposomes from 120 nm up to 760 nm promote and • diameter of the acceptor liposomes smaller than 100 nm or higher than 1.000 nm inhibit the GLTP catalysed transfer of NBD-Glu and NBD-Gal.

The calculated maximum transfer rate of NBD-Glu is at a PS ratio of 20 % and the maximum transfer of NBD-Gal is at a PS ratio of 22 %.