Entwicklung und Evaluierung von PCR-Methoden zum Nachweis vom Coccidioides posadsaii

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer molekularbiologischen Methode zum spezifischen Nachweis von DNA des dimorphen Pilzes Coccidioides posadasii. Er verursacht die ausschließlich auf dem amerikanischen Kontinent in wüstenartigen Regionen endemische Kokzidioidomykose. Die Diagnostik dieser gelegentlich nach Europa importierten Systemmykose beschränkt sich auf immundiagnostische Tests und die Erregeranzucht. Neben der mäßigen Sensitivität dieser Verfahren ist die Kultur noch dadurch limitiert, dass C. posadasii ausgesprochen infektiös ist und die Anzucht auf Laboratorien der biologischen Sicherheitsstufe 3 beschränkt ist. Grundvoraussetzung für die Entwicklung einer PCR war daher der Nachweis dass die angewandte Methode nicht nur erfolgreich DNA extrahiert sondern auch, dass das Probenmaterial sicher nicht mehr infektiös ist. Es wurden Suspensionen von 10 verschiedenen C. posadasii-Stämmen unter entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen hergestellt und nach einem modifizierten kommerziellen DNA-Extraktionsprotokoll bearbeitet. Zur Zerstörung der Pilzzellwände wurden drei Zyklen bestehend aus Einfrieren in Flüssigstickstoff und Kochen eingefügt. Die parallel bearbeiteten Suspensionen wurden nach jedem Schritt erneut kultiviert, um die Vitalität und damit die Infektiösität nachzuweisen resp. auszuschließen. Pilze waren nur aus unbehandelten Suspensionen wieder anzüchtbar, während alle anderen Kulturen steril blieben. Damit gelang der Nachweis, dass mindestens drei Schritte des Extraktionsprotokolls jeweils alleine bereits ausreichend sicher die Infektiösität der Proben eliminieren.

Daraufhin wurde die DNA aus 120 klinischen Isolaten von C. posadasii aus dem Endemiegebiet in Monterrey in Mexiko nach diesem Protokoll extrahiert. Zusätzlich wurden Gewebeproben untersucht, in denen entweder mikroskopisch eine Kokzidioidomykose diagnostiziert oder eine andere Systemmykose identifiziert worden war.

Für die in dieser Arbeit entwickelten PCR-Verfahren wurde die Zielsequenz in einem Gen gewählt, welches für das erregerspezifische „antigen 2/proline-rich antigen“ (Ag2/PRA) kodiert. Während das erste PCR Produkt 526 Basenpaare lang ist, weist das nested Produkt 342 Nukleotide auf. Die Hybridisierungssonden des real-time PCR-Verfahrens (LightCycler) sind komplementär zu Nukleotidregionen innerhalb des Nested-PCR Produktes. Mit beiden PCR-Verfahren konnte DNA aus allen 120 Stämmen amplifiziert werden, während das mit DNA aus Stämmen anderer Pilzgattungen nicht gelang. Die Sequenzierung des 526 bp langen Amplifikates der ersten PCR von 35 zufällig ausgewählten Isolaten und die Schmelzkurvenanalyse der Light-Cycler PCR aller 120 Stämme zeigten entweder eine 100% Übereinstimmung mit der Gensequenz von C. posadasii (accession number in GenBank: AF013256) oder eine einzige stumme Mutation ausschließlich in der in der Nukleotidposition 1228 (Guanosin statt Cytosin). Neben der hohe er Spezifität der PCR-Verfahren konnte mittels klonierter Plasmid-DNA auch die Sensitivität des konventionellen PCR-Verfahrens bestimmt werden, die ein Detektionslimit von 1 fg aufwies.

Die zwei Spezies der Gattung Coccidioides werden anhand zweier Mikrosatelliten-tragender Gene (GAC und 621.1) unterschieden. Durch die Längenbestimmung beider Mikrosatelliten wurden 117 von 120 in dieser Arbeit untersuchten Isolate als C. posadasii identifiziert.

Mit der konventionellen nested-PCR konnte spezifische Coccidioides-DNA aus drei histologisch als Kokzidioidomykose identifizierten Gewebeproben amplifiziert werden, während die DNA aus 20 paraffin-eingebetteten Gewebeproben mit anderen Systemmykosen negativ blieben. Das damit erkennbare diagnostische Potenzial der neu etablierten PCR-Verfahren zum Nachweis von Coccidioides spp. bleibt in Studien anhand klinischer Materialien weiter zu evaluieren.

This work`s aim was the developement of a molecularbiological method for the specifical detection of DNA of the dimorphic fungus Coccidioides posadasii. It causes the exclusivly in desert regions on the american continent endemic coccidioidomycosis. Diagnosis of this, occasionally to europe imported, systemmycosis is limited to immunodiagnostic tests and culture. Besides the method`s modest sensitivity, culture is also limited because C. posadasii is extremely infectious and culture is restricted to laboratories of the biosafety level 3. Precondition for the development of a PCR was thus to proof, the used method does not only extract DNA successfully, but also the material was certain no more infective. Suspensions of 10 different C. posadasii strains were created under definite safety instructions and treated after a modified kommercial DNA extraction procedure. In order to destruct the cell walls, three cycles of freezing in fluid nitrogen and boiling were added. The parallel treated suspensions were cultivated again after every step to proof or exclude vitality and thus infectiousity. Fungi were only cultivated from suspensions, which were untreated, whereas all the other cultures remained sterile. Thus could be proofed, that at least three steps of the extraction procedure and each of them alone, eliminate infectiousity sufficiently.

Thereupon, recording to this procedure, DNA of 120 clinical isolates of C. posadasii of the endemic region Monterrey in Mexico was extracted. Additionally, tissue probes were examined, in which microscopically either coccidioidomycosis or another sistemic fungal disease were identified.

The target sequenz of the PCR assay was chosen within a gene encoding the specific 'antigen2/proline-rich antigen' (Ag2/PRA). The product of first PCR has a length of 526 basepairs, the nested PCR-product consists of 342 nucleotides. The LightCycler hybridization probes are complimentary to the nucleotide regions within the nested PCR-product. Both PCR assays amplified DNA of all 120 strains, whereas DNA of other stains of different fungal geni could not be amplified. Sequencing of the 527-bp product obtained from 35 strains demonstrated either a complete identity the sequence in GenBank database (accession number AF013256), or an exchange of cytosine to guanosine at position 1228. Besides the PCR assay`s high specifity, sensitivity could be determined for the conventional nested PCR assay, which demonstrated a detection limit of 1 fg.

The two spezies of the genus Coccidioides are decided by two microsatellie-containing loci (GAC and 621.1). 117 of 120 strains could be identified as C. posadasii.

The conventional nested PCR could amplify a specific product from three biopsie positive for spherules by microscopy, whereas no product was amplified from DNA extracted from samples positive for other dimorphic fungi. The diagnostic potential of the newly established assay for detection of Coccidioides ssp. remains to be evaluated in further research projects.