Etablierung und Evaluierung einer Real-time RT-PCR zur quantitativen Analyse der Genexpression von 7 humanen Zytokinen

Abstract

Über den quantitativen Nachweis der Zytokin-Produktion unter pathologischen Bedingungen lassen sich Informationen über die stattfindenden Immunprozesse gewinnen. Die relativ neue Technik der Real-time RT-PCR wird dabei wegen ihrer leichten Durchführbarkeit, hohen Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit zunehmend zur Quantifizierung der Zytokin-Genexpression eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurde im LightCycler Instrument unter Anwendung eines identischen Reaktionsansatzes und eines konstanten PCR-Protokolls ein Real-time RT-PCR-Assay zur absoluten Quantifizierung der mRNA-Expression für die folgende Auswahl an Zytokinen etabliert: IL-4, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18, TNF-alpha sowie IFN-gamma. Sie sind neben anderen Zytokinen wesentlich an der Pathophysiologie von Komplikationen nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (SZT) beteiligt. Für die einzelnen Zytokine wurden externe Standards generiert, die eine absolute Quantifizierung ermöglichen. Über den Einsatz der Standards in die Light-Cycler RT-PCR wurde die Methode evaluiert. Es zeigte sich dabei zu anderen Real-time RT-PCR-Assays eine vergleichbare Reproduzierbarkeit sowie eine hohe Sensitivität für die verschiedenen Zytokine (Detektionslimit IL-4, IL-8, IL-10, TNF-alpha und IFN-gamma: 100 Kopien; IL-12, IL-18: 1000 Kopien). Hybridisierungs-Sonden gewährleisten außerdem eine hochspezifische PCR-Produkt-Detektion. Mit dem hohen Durchsatz (25 Proben/48min) sowie dem breiten Spektrum an Zytokinen stellt die vorliegende Methode ein effizientes Verfahren zur Erstellung von Zytokin-Profilen dar. Ferner wurde die Normalisierung von Ergebnissen des Assays nach in vitro Stimulation von peripheren mononukleären Blutzellen gegen das Housekeeping-Gen h-beta2-Mikroglobulin demonstriert. Für die Anwendung der Methode unter anderen experimentellen Bedingungen muss erneut ein Housekeeping-Gen ausgewählt und geprüft werden, oder zumindest die alternative Standardisierung der Ergebnisse über die Masse der Gesamt-RNA oder die Zellzahl erfolgen. Das Verfahren kann nun im Labor für Forschungen auf dem Gebiet der allogenen SZT zum Einsatz kommen und eignet dabei auch zur Bestätigung ausgewählter Daten der Zytokin-Genexpression von DNA-Chip Experimenten. Die Methode lässt sich außer-dem schnell und einfach für die quantitative Analyse der Expression weiterer Zytokine, Zytokin-Rezeptoren oder anderen Mediatoren im Zytokinnetzwerk, die künftig von Interesse sind, evaluieren und ausbauen.

Detection and quantification of cytokines under pathological conditions is essential for the assessment of specific immune responses. Recently, real-time RT-PCR has become a major tool for quantifying cytokine gene expression levels. Because it is easy to perform and provides high sensitivity, specifity and reproducibility, the method is increasingly used to determine the amount of cytokine mRNA in different settings and clinical materials. Here, the LightCycler Instrument was used to perform the real-time RT-PCR, and one universal PCR mixture and a unique PCR protocol were developed for absolute quantification of mRNA expression levels of the following cytokine target genes: IL-4, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18, TNF-alpha and IFN-gamma. These cytokines play an important role in the pathophysiology of complications after allogeneic stem cell transplantation (SCT). For each specific cytokine target external standards were prepared to enable absolute quantification. The method was then evaluated performing repeated runs in the LightCycler RT-PCR with the external standards. Compared to other real-time RT-PCR assays similar reproducibility as well as high sensitivity was achieved (detection limit IL-4, IL-8, IL-10, TNF-alpha and IFN-gamma: 100 copies; IL-12, IL-18: 1000 copies). Moreover, the use of hybridization probes permits high specific PCR-product-detection. Both with the high-throughput (25 samples/48min) and the wide range of cytokine targets the developed assay results in an efficient method for cytokine profiling. Furthermore, after in vitro stimulation of peripheral blood mononuclear cells and performing the LightCycler assay, normalization of the results to the housekeeping gene h-beta2-microglobulin was demonstrated. However, in different experimental conditions another suitable housekeeping gene has to be established an evaluated. At least, the alternative normalization to the total RNA concentration or cell number must be taken into account. The assay is now used for investigation of complications after allogeneic SCT and further enables to confirm representative data from DNA chip experiments concerning the cytokine gene expression. Finally, the method can be easily and rapidly adapted to new RNA target molecules such as other cytokines, cytokine-receptors and many more mediators of interest in the cytokine network.