Einfluss von Polymorphismen im Promotor der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase auf die Aktivität in vitro

Abstract

Malaria ist eine parasitäre Infektionskrankheit, die durch verschiedene Arten von Plasmodien ausgelöst wird. Dabei hat Plasmodium falciparum, der Erreger der Malaria tropica, den größten Stellenwert: er verursacht die meisten Krankheitsfälle und die schwersten Verlaufsformen Die Immunreaktion bei Malaria stützt sich auf zelluläre und humorale, spezifische und unspezifische Mechanismen. In verschiedenen klinischen Studien und in vitro konnte gezeigt werden, dass Stickstoffmonoxid bei der Abwehr von Malaria eine wichtige Rolle spielt und zur Pathologie der Erkrankung beiträgt. Stickstoffmonoxid wird von der induzierbaren NO-Synthase gebildet. In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss mehrerer Polymorphismen im Promotor der iNOS auf die Promotoraktivität untersucht werden. Dazu wurden mehrere Plasmide konstruiert, die Abschnitte verschiedener Länge und mit verschiedenen Mutationen aus den proximalen 6 kb des iNOS-Promotors enthalten, darunter die Lambaréné-Mutation (-954 G/C) und das CCTTT-Repeat bei -2,5 kb. Diese Plasmide wurden in eine menschliche Lungenzelllinie transfiziert und mit IFN gamma, LPS, TNF alpha und IL1 beta stimuliert. Mittels eines Luziferase-Assays wurde die Aktivität der Promotorabschnitte gemessen. Es konnte gezeigt werden, dass der Wildtyp eines 6 kb-Promotorkonstruktes 1,5mal besser stimuliert werden kann als der gleiche Abschnitt mit Lambaréné-Mutation. Dieses Ergebnis bestätigt frühere Studien. Eine erhöhte Basalaktivität durch die Lambaréné-Mutation konnte nicht gefunden werden. Die Konstrukte mit einem 6 kb-Promotorinsert zeigten eine wesentlich geringere basale und stimulierte Aktivität als alle anderen Plasmide mit kleineren Promotorfragmenten.

Malaria is a parasitic infection caused by different plasmodium species. P. falciparum is responsible for most severe cases and deaths. Human immune response to malaria involves cellular and humoral and specific and nonspecific mechanisms. Several clinical studies and in-vitro experiments have demonstrated the important role of nitric oxide in malaria defence and pathophysiology. Nitric oxide is produced by the inducible nitric oxide synthase (iNOS). This study intends to investigate the effects of polymorphisms in the iNOS promoter on promoter activity. For this purpose we constructed several plasmids which contain various regions from the proximal 6 kb of the promoter and several polymorphisms, e.g. a single nucleotide substitution at -954 (G / C) and a CCTTT repeat at -2.5 kb. The plasmids were transfected into human A549 alveolar cells and stimulated with IFN gamma, LPS, TNF alpha, and IL-1 beta. The activity of the promoter regions was measured with a luciferase assay. It was demonstrated that the single nucleotide substitution at -954 (G / C) in a 6 kb promoter construct significantly decreases the stimulated promoter activity compared to that of the wild-type construct. This confirms the results of other groups. Increased basal activity in the -954 (G / C) constructs could not be found. Plasmids with a 6 kb promoter insert were found to have substantially lower basal and stimulated activity than constructs with smaller promoter inserts.