Mechanismus der Hemmung von CRAC-Kanälen im Rahmen CD95-vermittelter Apoptose

Abstract

Zielsetzung dieser Arbeit war es, den Signalweg aufzuklären, über den die Stimulation des CD95-Rezeptors CRAC-Kanäle hemmt. Da das Calcium-Signal der T-Zellrezeptor-Aktivierung für die Proliferation und Zytokinproduktion erforderlich ist, stellt die Hemmung von CRAC-Kanälen einen Mechanismus dar, über den Lymphozyten in einen Zustand versetzt werden, in dem sie nicht mehr auf Antigen reagieren können. So könnten sich CD95-Ligand exprimierende Tumoren der Immunabwehr entziehen. Unter Verwendung von Bcl-2 überexprimierenden Zellen konnte gezeigt werden, dass Bcl-2 in der Lage ist, den Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials DYm im Rahmen der CD95-vermittelten Apoptose zu verhindern. Damit wird auch der CRAC-Block vollständig verhindert. Beide Vorgänge stehen nicht nur zeitlich in engem Zusammenhang. Die Verwendung von Bcl-2 in unterschiedlichen intrazellulären Lokalisationen zeigte außerdem, dass die Verhinderung der mitochondrialen Depolarisation und der Schutz vor CRAC-Block durch unterschiedlich lokalisiertes Bcl-2 nach genau dem selben Muster verlief. Nur mitochondrial lokalisiertes Bcl-2 konnte den CRAC-Block wie auch den DYm-Zusammenbruch uneingeschränkt wirksam verhindern. Am ER lokalisiertes Bcl-2 oder gar zytosolisches Bcl-2 waren weniger wirksam bzw. wirkungslos. Die Ergebnisse dieser Arbeit schliessen eine unmittelbare Hemmung von CRAC durch den CD95-Rezeptor aus. Dafür zeigen sie einen direkten Zusammenhang zwischen DYm-Zusammenbruch und CRAC-Block. Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, dass nur funktionierende Mitochondrien CRAC-Kanäle offen halten, indem sie Calcium aufnehmen und so eine Selbsthemmung der Kanäle verhindern. Diese Studie beweist erstmals, dass der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials DYm ein essentieller und hinreichender Schritt für die Hemmung von CRAC-Calcium-Kanälen nach CD95-Rezeptorstimulation ist.

This study was designed to investigate the signal transduction pathway by which stimulation of the CD95-receptor leads to inhibition of CRAC-channels. Since the calcium signal of the T-cell receptor activation is necessary for the proliferation and cytokine-production, the inhibition of CRAC-channels is a mechanism by which lymphocytes can be set into a state in which they can't react to antigen any more. That way CD95-ligand expressing tumors may evade the immune system. Using bcl-2 overexpressing cells, it could be shown that bcl-2 is capable of preventing the mitochondrial membrane potential DY in CD95-induced apoptosis. That way the block of CRAC was also completely prevented. Both phenomenoms are not only similar in the timing of their occurance. Using bcl-2 in different intracellular localisations it could be shown that preventing CRAC-block and protection from mitochondrial depolarisation by different kinds of intracellular localisation occured exactly in the same pattern. Only bcl-2 at the mitochondria could prevent both CRAC-block and mitochondrial depolarisation efficiently. Bcl-2 located at the ER or cytosolic bcl-2 were much less efficient. The results of this study can rule out a direct inihibition of CRAC by CD95. But they do show a direct relation between mitochondrial depolarisation and CRAC-block. These conclusions are supported by the observation that only functioning mitochondria can keep open CRAC-channels by removing calcium and thereby preventing self-inhibition of CRAC-channels. This study shows for the first time that mitochondrial depolarisation is an essential and sufficient step in the inhibition of CRAC-Channels after CD95-receptor-stimulation.