Untersuchungen zur Prävention der Graft-versus-Host Erkrankung im murinen Modell durch den Einsatz neuer synthetischer Peptide

Abstract

Röllinghoff, Barbara Untersuchungen zur Prävention der Graft-versus-Host Erkrankung im murinen Modell durch den Einsatz neuer synthetischer Peptide

Die GVHD stellt eine lebensbedrohliche Komplikation nach allogener Stammzelltransplantation dar. Sowohl die akute als auch die chronische GVHD ist eine T-Zell vermittelte Reaktion gegen Zielgewebe des Empfängers. In der vorliegenden experimentellen Arbeit wurde modellhaft untersucht, ob durch gezielte Modulation des T-Zell-Antigenerkennungsprozesses die Graft-versus-Host Erkrankung im murinen Modell verhindert werden kann. Durch den Einsatz prädiktiver allelspezifischer Peptide unterschiedlicher Länge mit hoher Affinität für Klasse-II MHC-Moleküle wurden Auswirkungen auf die Antigenerkennung im murinen Modell, mögliche sterische Effekte und eine daraus resultierende Blockade der GVHD Antwort im Detail untersucht. Desweiteren wurden mittels Applikation bifunktionaler Peptide mögliche Einflüsse auf eine duch Superantigene verstärkte GVHD getestet. Die GVHD wurde durch Transplantation von Knochenmarksstammzellen und Milzzellen eines mHAg-(Nebenhistokompatibilitätsantigen-) inkompatiblen Mäuse- stamms (B10.D2Balb/c) ausgelöst. Autolog transplantierte Mäuse (Balb/cBalb/c) dienten als Kontrollgruppen. Die Applikation einer unspezifisch bindenden Negativkontrolle sowie einer Leerkontrolle zeigte keinen Effekt. Als Vergleichspeptid wurde der randomisierte Copolymer GLAT eingesetzt, dessen inhibitorische Wirkung auf die Induktion einer GVHD in vivo schon in früheren Studien demonstriert werden konnte. Das Ausmaß der GVHD wurde makroskopisch nach dem Aufteten klinischer Zeichen der transplantierten Tiere bewertet. Nachfolgend wurden histologische Präparate aus Ileum, Colon und Haut gewonnen und Gefrierschnitte mit der ABC-Immunperoxidase Technik gefärbt. Die Expression GVHD assoziierter Moleküle wurde in den Schnitten semiquantitativ sowie computergestützt bewertet. Die in vivo Daten der hier vorliegenden Untersuchung sind konsistent mit der Arbeitshypothese, daß die eingesetzten allelspezifischen Peptide aufgrund ihrer hohen Affinität für Klasse-II MHC Moleküle (Typ H-2d) die Antigenpräsentation verhindern. Ihre Applikation über einen zeitlich begrenzten Zeitraum nach Transplantation vermag die Induktion der gegen minor Antigene gerichteten GVHD im murinen Modell deutlich zu reduzieren. Die Ergebnisse mit den Peptiden CLIP (16 Aminosäuren Länge), Cop-CLIP 10 (36 AS Länge) und APE 20 (56 AS Länge) zeigen, daß die Effektivität der GVHD Prävention positiv mit der Länge der applizierten Peptide korrelierte. Zusätzlich zu einer Interaktion dieser Peptide mit dem T-Zell-MHC Klasse II Antigenerkennungsprozess macht dies sterische Effekte wahrscheinlich. Die Applikation des Peptids APE-Spacer-TCR, für das neben der Wechselwirkung mit dem Klasse-II MHC-Molekül auch Interaktionen mit Superantigen-vermittelten Prozessen angenommen werden, zeigte in der Prävention der über minor Antigene induzierten und durch Mtv-kodierte Superantigene verstärkten GVHD die höchste Effektivität. Obwohl ein eindeutiger Wirkungsmechanismus nicht endgültig bewiesen werden konnte, ist auf Basis der hier präsentierten Daten vorstellbar, daß dieses Peptid seine Wirkung in der Tat bifunktionell entfaltet und somit besonders deutlich die Ausprägung der GVHD zu reduzieren vermag. Die hier im murinen Modell der GVHD gewonnenen Daten tragen zu neuen Erkenntnissen über eine gezielte Modulation der T-Zellvermittelten Immunantwort bei und sollen somit Anstoß zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze im Rahmen der GVHD-Prävention geben.

Rölinghoff, Barbara

Investigations into the prevention of graft-versus-host disease in a mouse model by the use of new, synthetic peptides

Graft-versus-host disease (GVHD) is a potentially fatal complication if it arises after allogeneic stem cell transplantation. Not only the acute form of GVHD, but also the chronical form represents a T-cell mediated reaction against targeted tissue of the recipient. In the present experimental study, a model investigation was carried out to determine whether GVHD can be prevented in the mouse model by targeted modulation of the T-cell recognition process. The application of predictive, allele-specific peptides of various lengths with high affinity for class II MHC molecules allowed a close examination of the effects on antigen recognition in the mouse model, the possible steric effects and the resulting blockade of the GVHD response. In addition, the possible influences on GVHD enhanced by superantigens could be determined by the application of bifunctional peptides.

GVHD was induced by the transplantation of bone marrow stem cells and spleen cells from a minor histocompatibility antigen (mHAg)-incompatible mouse strain (B10.D2Balb/c). Autologous transplanted mice (Balb/cBalb/c) were used as controls. No effect could be determined after the application of a nonspecifically binding negative control, nor a blank control. The randomised copolymer GLAT was used as a comparative peptide: the inhibitory effects of GLAT on the induction of GVHD have already been documented in previous studies. The extent of GVHD was assessed macroscopically after the first appearance of clinical symptoms in the transplanted animals. Histological specimens taken from the ileum, colon and skin were subsequently cut into frozen sections and stained using the ABC-immunoperoxidase technique. The expression of GVHD-associated molecules was analysed in the sections both semi-quantitatively and computer-assisted.

The in-vivo data obtained in the present study are consistent with the working hypothesis: because of their high affinity for class II MHC molecules (H-2d), the allele-specific peptides in use indeed prevent antigen presentation. By applying such peptides over a certain length of time after transplantation, the induction of GVHD targeted against minor antigens in the mouse model can be clearly reduced. Results obtained with the CLIP (16 amino acids in length), Cop-CLIP 10 (36 AA in length) and APE 20 (56 AA in length) peptides demonstrate that the effectivity of GVHD-prevention correlates positively with the length of the applied peptides. In addition to an interaction of these peptides with the T-cell MHC class II antigen recognition process, steric effects are probably also involved. The application of the peptide APE-Spacer-TCR, which is not only presumed to be involved in the interaction with class II MHC molecules, but also in interactions with superantigen-mediated processes, revealed the greatest effectivity in the prevention of GVHD that is induced via minor antigens and enhanced by Mtv-coded superantigens. Even though a mode of action could not be demonstrated unequivocally, on the basis of the data presented here it is certainly feasible that this peptide unfolds its effect bifunctionally and is thus able to reduce the extent of GVHD considerably. The data obtained here in the mouse model of GVHD lead to new insights into a targeted modulation of the T-cell mediated immune response and should therefore provide an impulse for the development of new therapeutic methods in the prevention of GVHD.