Systematische Evolution von DNA-Aptameren zur Charakterisierung und Diagnostik von pathologisch veränderten Endothelzellen in Tumoren und entzündlichen Regionen des Rattenhirns

Abstract

Dok. 1 (Version mit hoher Abbildungsqualität) Dok. 2 (Version mit reduzierter Bildqualität) ************************ Mikrogefäße bildende Endothelzellen sowohl in Tumoren als auch in entzündlichen Erkrankungen des Gehirns unterscheiden sich von denen gesunder Blutgefäße durch eine veränderte Struktur und einen veränderten Metabolismus. Die mit diesen Erkrankungen einhergehende Aktivierung von Endothelzellen äußert sich in quantitativen und qualitativen Unterschiede in der Expression von Endothelzellproteinen. Solche Proteine haben das Potential als molekulare Adressen zu fungieren, welche aktivierte Gefäße von ruhenden, gesunden Gefäßen des Normalhirns unterscheidbar machen. In dieser Arbeit wurde die kombinatorisch chemische Methode ?Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)? eingesetzt um ssDNA-Liganden ? DNA-Aptamere genannt ? gegen transformierte Endothelzellen zu selektieren. In Analogie zu Antikörpern konnten selektierte Aptamere als histologische Marker auf Gewebeschitten zur selektiven Erkennung der Mikrovaskulatur experimenteller Glioblastome der Ratte (als Modell für Glioblastom-Hirntumoren) und der Mikrovaskulatur der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE; als Modell für Multiple Sklerose) eingesetzt werden. Die normalerweise radioaktiv kontrollierte SELEX- und Dekonvolution-SELEX-Prozedur wurde hierbei durch fluoreszenz-basierte Methoden (Durchflußzytometrie und Fluoreszenzmikroskopie) ersetzt. Von 52 getesteten Aptameren erkannten 21 Aptamere selektiv die aktivierte Mikrovaskulatur des pathologischen Rattenhirns, nicht aber die Vaskulatur des gesunden Rattenhirns. Darunter Aptamer III.1, welcher exemplarisch genauer untersucht wurde.

Dok. 1 (high picture quality) Dok. 2 (reduced picture quality) ************************ Microvessel forming endothelial cells (EC) in brain tumors and in the inflamed regions of the brain differ in structure and metabolic function from normal vasculature. EC activation in these diseases is associated with quantitative and qualitative changes in the expression of EC specific proteins. Such molecules could serve as molecular addresses differentiating the activated vasculature from those of the normal brain. The combinatorial chemistry method ?Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)? was applied against transformed endothelial cells as a complex target to select ssDNA-ligands (DNA-aptamers) that function as a histological marker (in analogy to antibodies) to detect microvessels of rat experimental glioma (as a model for highly vascularized glioblastoma brain tumors) and microvessels of rat experimental autoimmune enzephalomyelitis (EAE; as a model for multiple sclerosis). As an alternative to the normally radioactive controlled procedure, both, the enrichment of EC binding aptamers in the successive rounds of selection and amplification as well as subsequent deconvolution-SELEX were analyzed by fluorescence based methods (flow cytometry and fluorescence microscopy). Out of 52 aptamers analyzed, 21 aptamers were identified that bound selectively to microvessels of the pathologic rat brain but not to the vasculature of the normal rat brain. One aptamer (termed aptamers III.1) was chosen as a candidate to be characterized more detailed.