Beschleunigter Nachweis von Salmonellen in Lebensmitteln durch Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) mit 23S rRNA Sonden

Abstract

Im Rabmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe der FISH-Technik Salmonellen auf der Basis ihrer genetischen Substanz, der 23S rRNA, innerhalb kurzer Zeit (4 Stunden) aus der Voranreicherungskultur von Lebensmittelproben nachgewiesen. Die markierten rRNA-Hybride wurden über ein Fluoreszenzmikroskop-System in Form von sichtbaren Signalen erkannt.Es wurden drei Sonden (Sal-1, Sal-3 und Sal-544), basierend auf der Sequenzanalyse, eingesetzt. Die drei Sonden erwiesen sich als gattungsspezifisch und erkannten alle getesteten Salmonella enterica Subspezies Enterica I, weiche fast alle Stimme mit medizinischer Bedeutung enthält. Nicht Salmonella-Referenzstämme hybridisienen nicht mit den drei Sonden. In den Vorversuchen wurden eine Optimierung der Hybridisierungsbedingungen und der Voranreicherungszeit durchgeführt. Die Anwendung der drei Sonden wurde auch für natürlich kontaminierte Lebensmittelproben erfolgreich durchgeführt. Von insgesamt 225 Proben konnten 52 positive Proben mit der Sonde Sal-1, 56 positive Proben mit der Sonde Sal-3 und 35 positive Proben mit der Sonde Sal544 durch die FISH-Verfahren nachgewiesen werden. Mit der kulturellen Methode wurden nur 30 positive Proben nachgewiesen und bestimmt. Die FISH-Verfahren mit der Sonden Sal-1 oder Sal-3 war signifikant häufiger positiv als die kulturelle Methode, mit der Sonde Sai-544 konnte eine solche Signifikanz nicht festgestellt werden, Die FISH-Technik und die kulturelle Methode haben beide den Vorteil, daß lebende Salmonellen nachgewiesen werden. Der Vorteil der FISH-Technik gegenüber der kulturellen Methode ist jedoch noch, daß sie einfacher, spezifischer, sensitiver und mit weniger Material -und Zeitaufwand durchgeführt werden kann Das FISH-Verfahren erscheint als besonders geeignet für Lebensmittelunternehmen, für die ein qualitatives Ergebnis ausreicht.

This study describes a new detection technique to identify Salmonella species from food using fluorescent in situ hybridization (FISH) with 23S rRNA-targeted oligonucleotide probes. Three species-specific 23S rRNA-targeted oligonucleotide probes were selected (Sal-1, Sal-3) or newly designed (Sal544). The specificity of these probes was compared with bacterial 23S rRNA sequences of the Genbank database and was tested by in situ hybridization of bacterial cell smears of pure cultures. 51 tested reference strains of Salmonella serovars that belong to subspecies I (enterica) hybridized with these probes. No cross-reaction to 46 other strains of the family Enterobacteriaceae or 14 other bacterial strains outside this family was observed. Storage conditions of a S. Panama test strain under various environmental pressures (2, 5, 15 NaCl; -20°C, 4°C, room temperature and pH 3.3-7.4) did not adversely affect the FISH method. No matrix-effects were seen for 18 different kinds of food. Salmonella spp. could be detected from a pre-enrichment broth after 16 h incubation in 52 (probe Sal-1), 56 (probe Sal-3) and 35 (probe Sal544) of 225 naturally contaminated food samples. By conventional culturing, Salmonellae were isolated from only 30 of these 225 samples. On the other hand, FISH failed to identify Salmonellae in only 2 (Sal-1 and Sal-3), and 3 (Sal544) samples from which the pathogen was cultured.