Herstellung und Untersuchung von Prion-Reporter-Fusionsproteinen

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Generierung von in vitro konvertierbaren Prionprotein- Reporterprotein- Fusionskonstrukten zur weiteren Erforschung des Prionproteins und seiner Rolle bei TSE- Erkrankungen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden verschiedene Prionprotein- EGFP- und Prionprotein- Luciferase- Fusionskonstrukte erstellt und in verschiedenen Expressionssystemen exprimiert und analysiert. Die transiente Transfektion eukaryotischer Zellkulturen war für diese Ziele nicht geeignet, da die Transfektionseffizienz schwankte und die Expressionsraten der rekombinanten Proteine sehr niedrig waren. Ähnliche Probleme traten bei der in vitro Transkription und Translation der Proteine auf, da die Menge an generierten Proteinen für weiterführende Analysen zu gering war. Große Mengen an rekombinantem Protein konnten durch bakterielle Expression erhalten werden, aber die Aufreinigung der Proteine musste denaturierend erfolgen, was im Anschluss recht aufwendige Renaturierungsschritte derselben erforderte. Durch die virale Expression der rekombinanten Proteine in Insektenzellen wurden ausreichende Mengen an rekombinantem Protein erhalten. Die Aufreinigung der Proteine konnte nativ erfolgen und erforderte keine Renaturierung. Die Expression der Fusionskonstrukte in Sf9- Zellen mit dem Baculoexpressionssystem wurde als Thema einer Diplomarbeit von C. Fuchs (2004) im Rahmen dieser Doktorarbeit bearbeitet. Aus diesen Gründen wurden Konversionsversuche vor allem mit Fusionsproteinen aus Baculo- infizierten Insektenzellen durchgeführt. Die Analyse von Prion- EGFP- und von Prion- Luciferase- Fusionsproteinen ergab für die mit Luciferase markierten Fusionsproteine eine mögliche sterische Hemmung bei N- terminaler Fusionierung des Enzyms mit dem Prionprotein. Bei Prionprotein- EGFP- Fusionskonstrukten wurden bis zu den Konversionsversuchen keine Beobachtungen dieser Art gefunden, weshalb die Konversionsversuche auf die mit EGFP markierten Fusionsproteine gerichtet waren. Die Konversion der Fusionsproteine wurde mit einer modifizierten PMCA untersucht. Für Bac230egfp gab es in zwei Experimenten Hinweise auf eine Konversion des rekombinanten Proteins in eine Proteinase K- resistente Form. Dieses Ergebnis ist als vorläufig zu betrachten und muß bezüglich der Konversionsbedingungen und Nachweismethoden optimiert werden.

The Goals of this thesis were the generation of in vitro convertible prion- reporter- fusionproteins for further research of prion protein and its role in TSE diseases. In order to achieve this goal different prion – EGFP- and prion- luciferase- fusionconstructs were developed and expressed and analysed in different expression systems. Transient transfection of eukaryotic cells did not qualify to achieve these goals as the efficiency of transfection varied and expression rates of the recombinant proteins were low. Similar problems emerged by in vitro transcription and translation of the recombinant proteins because the amount of generated proteins were too low for continuative work. High yields of recombinant proteins were given by bacterial expression but purification of proteins had to be done under denaturing conditions. Subsequently complex renaturation of the protein was required. It was found that viral expression of recombinant proteins in insect cells obtained sufficient amounts of proteins. Purification of these proteins could be done under native conditions and required no renaturation. Within this thesis the expression of fusionconstructs in Sf9- cells with Baculo- expression system were an issue of a diploma thesis of C. Fuchs (2004). For these reasons the conversion experiments were mainly carried out with fusionproteins of Baculo- infected cells. The analysis of prion- luciferase- fusionproteins showed a possible steric hindrance by n- terminal fusion of the prion protein with the enzyme. This observation was made with both viral expressed and mammalian expressed prion- luciferase- fusionproteins. No observations like this were found for the prion- EGFP- fusionproteins and for this reason the conversion experiments were aimed at the EGFP- tagged prion proteins. Conversion of recombinant proteins were analysed with an in vitro PrPSc amplification technique adapted from protein misfolding cyclic amplification. For Bac230e there were in two experiments references to a conversion of the recombinant protein in a proteinase K- resistant form. This result is to be regarded as temporary and must be optimised with regard to the conversion terms and proof methods.