Kombinatorische Wirkstofftestung - Entwicklung eines neuartigen diffusionsgestützten Bioassays und Einfluss von Kinaseinhibitoren auf die T-Zell Signaltransduktion

Abstract

In der kombinatorischen Substanztestung steigen, mit gebräuchlichen Mikro-titerplatten-Methoden, die benötigten Pipettierschritte mit der Anzahl der verwendeten Konzentrationen und Substanzen exponentiell an. Die Verminderung von Pipettierschritten in kombinatorisch angelegten Experimenten bedeutet daher eine wichtige methodische Weiterentwicklung. In der klinischen Anwendung von Chemotherapeutika sind empirische Daten immer noch Grundlage für die Behandlungspläne von Krebspatienten. Dabei werden Subpopulationen von Patienten, die weniger oder gar nicht auf eine bestimmte Substanzkombination reagieren, nicht ausreichend berücksichtigt. Der Ansatz der Testmethode, welche in dieser Dissertation vorgestellt wird, mit der individuelles Ansprechen von Patienten auf Wirkstoffe vorhergesagt werden kann, soll helfen die Behandlung von Krebspatienten in der Zukunft zu verbessern. Um die genannten Verbesserungen zu erreichen, wird das Phänomen der Diffusion ausgenutzt, welche in dem dafür neu entwickelten sogenannten "Diffusion Device" Anwendung findet. Durch die orthogonale Anordnung zweier Diffusionsrichtungen wird hierbei die Möglichkeit geschaffen, stufenlos unendlich viele Mischungs-verhältnisse zu erreichen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Funktionsweise und Anwendung des Diffusion Device optimiert und mit einem zellbasierten Bioassay verbunden. Dazu wurde der Diffusion Device zuerst auf alle für die Diffusion wichtigen Parameter untersucht und validiert. Danach wurden chemotherapeutische Substanzen im Diffusion Device auf Zelllinien und primäre Zellisolate getestet. Bei den dabei implementierten Bioassays handelt es sich um einen annexinbasierten Apoptosenachweis und einen MTT-Zytoxizitätstest. Prioritäten der Arbeit lagen auf der einfachen Handhabung und dem geringen Gebrauch von Resourcen und technischem Equipment. Ebenfalls wichtig war die Möglichkeit der parallelisierten Anwendung der Devices, um mehrere Zelllinien, Zellisolate oder Wirkstoffe gleichzeitig und zeitsparend messen zu können. Potentielle Anwendungsgebiete dieser Methode sind das Sekundärscreening von Kombinations-Wirkstoffkandidaten und die Diagnostik von Krebspatienten für eine individeulle Behandlung mit Chemotherapeutika. Zusätzlich wurden für die Mikroarray-Arbeit "stimulus dependence of the action of small-molecule inhibitors in the CD3/CD28 signaling network" (Kohler et al. 2008), kombinatorische Experimente mit T-Zellen durchgeführt. Hier wurde gezeigt, dass die unterschiedliche Gewichtung von CD3/CD28 Stimulationen zu unerwarteten Ergebnissen bei der Testung von Kinaseinhibitoren führen kann. Dafür wurden verschiedene Kinaseinhibitoren und auch kleine inhibitorische Moleküle, wie Ciclosporin und FK506, die den T-Zell Signalweg beinflussen können, angewendet. Als Messgröße für die Stimulation der T-Zellen wurde die IL-2 Expression herangezogen und mittels ELISA bestimmt.

In experiments with combinations of substances, pipetting steps in standard micro plate methods increases exponentially with the number of substances and the concentrations which should be tested. Minimizing these pipetting steps in combi-natorial experiments could mean a good improvement for further methodical development. In the clinical application of chemotherapeutics primarily empirical findings are crucial. Thereby patient subgroups which don't or less respond to a certain drug combination are often not considered. The approach of the preclinical method presented in this dissertation with which individual patient responses could be foreknown, can be an important development in the treatment of cancer patients. To reach these aims the phenomena of diffusion has been employed. Therefore a so called "diffusion device" has been invented. Due to an orthogonal arrangement of two diffusion directions we had the ability to create many substance mixtures. In this present dissertation the handling and function of the "diffusion device" has been optimized and a cell based bioassay has been implemented. Potential application areas for this approach are the secondary screening of drug candidates or the application in the field of individualized diagnostic. To accomplish this, first steps had been validation of all diffusion parameters of the diffusion device. Then chemotherapeutic substances were tested against cancer cell lines and primary cancer cells. The implemented bioassays were an annexin linked apoptosis assay and a MTT-cytotoxicity assay. Priority laid on simple handling and low equipment usage. The next step after implementation of the bioassays has been an implementation of parallelization with which the testing of several cell lines or drug combinations at once could been showed. In addition of the microarray work "stimulus dependence of the action of small-molecule inhibitors in the CD3/CD28 signaling network" (Kohler et al. 2008) combination experiments were carried out with t-cells. It was the aim to prove that different t-cell stimuli can lead to an unexpected result in kinase inhibitor testing. Therefore several kinase inhibitors had been applied as well as ciclosporin and FK506 under different stimuli ratios of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. As readout the expression of the cytokine IL-2 had been measured. Additionally some pharmacological kinase inhibitors which were not included in the microarray work of Kohler et al. had been used.