Nachweis und Charakterisierung der mutmaßlichen Adenylatkinase 7, eines ependymalen Proteins

Abstract

Ziel vorliegender Arbeit war, Gene zu finden, die spezifisch in Ependymzellen exprimiert werden. Gegebenenfalls sollte deren Charakterisierung zur Aufklärung der Funktionen von Ependymzellen beitragen. Zur Identifizierung ependymzell-spezifischer Transkripte wurde eine subtraktive cDNA-Bibliothek durchsucht, die mittels Subtraktion von Gehirn-cDNA von Ependym-cDNA erzeugt worden war. Dabei konnte das pAK7-Gen als Kandidat eines ependymzell-spezifisch transkribierten Gens identifiziert werden. Primär- und Sekundärstruktur von pAK7 wurden bioinformatisch charakterisiert, wobei als markantes Merkmal das Motiv katalytisch aktiver Adenylatkinase-Domänen in der Aminosäuresequenz ausgemacht wurde. Zur Ermittlung des pAK7-Transkriptionsprofils wurden verschiedene Gewebe und Zellkultursysteme mit Hilfe konventioneller und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion („Real-time PCR“) untersucht. pAK7-mRNA konnte ausschließlich in Geweben und Kultursystemen nachgewiesen werden, die kinocilientragende Zellen enthielten. Die Abhängigkeit der pAK7-Transkription von der Kulturdauer wurde in Hoden und Ependymzellkulturen mit Hilfe von „Real-time PCR“ analysiert. Die Spiegel der pAK7-mRNA zeigten den selben zeitlichen Verlauf wie diejenigen bestimmter Transkripte kinocilienassoziierter Gene. Um die Gewebeexpression von pAK7 studieren zu können, wurde ein Antiserum gegen ein C-terminales Peptid von pAK7 hergestellt. Affinität des Antiserums zum und Spezifität für das Antigen wurden mittels ELISA, mittels immuncytochemischer Anfärbung pAK7-exprimierender HEK-Zellen und mittels “Western blot“ nachgewiesen. Die Intensität des pAK7-Signals konnte in „Western blots“ durch Verwendung partiell gereinigten Antiserums optimiert werden. Mit Hilfe des für Immunanfärbungen eingesetzten Antiserums wurde das pAK7- Protein in Zellkulturen und Gewebeschnitten zellulär lokalisiert. pAK7 konnte dabei nur in kinocilientragenden Zellen nachgewiesen werden. Allerdings konnte die für möglich gehaltene Adenylatkinase-Aktivität in einem Adenylatkinase-Test nicht gefunden werden. Der Auffindung möglicher Interaktionspartner von pAK7 mittels des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems war kein Erfolg beschieden. Die Ergebnisse der Anwendung dieser diversen Methoden erlauben somit, pAK7 als ependymspezifisches Protein zu bezeichnen, das ausschließlich in kinocilientragenden Ependymzellen exprimiert wird. pAK7 kann daher als ein „marker“-Protein für diesen Zelltyp im Gehirn angesehen werden. Die physiologische Funktion von pAK7 konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Zukünftige Untersuchungen unter Verwendung von RNAi oder morpholino-substituierten Oligonucleotiden sollten Aufschlüsse über die Bedeutung des Proteins ergeben, beispielweise bei der Erzeugung des Cilienschlags.

The aim of the present study was to find ependyma-specific genes. Their characterisation should eventually contribute to clarify the function of ependymal cells. To identify ependyma-specific transcripts a subtractive cDNA library was screened. This library has been generated by subtraction of brain cDNA minus ependymal cDNA. Thereby the pAK7 gene could be identified as a candidate for ependyma-specificly transcribed genes. Primary and secondary structure of pAK7 were characterised bioinformatically thereby finding the motif of catalytically active adenylate kinase domains as the outstanding property in the amino acid sequence. To determine the transcription profile of pAK7 different tissues and cellculture systems were examined via conventionell and quantitative PCR (real-time PCR). pAK7 mRNA could be exclusively found in kinocilia-bearing tissues and cellculture systems.Testis and ependymal cellcultures were analysed by real-time PCR to determine time-dependent transcription of pAK7. Levels of pAK7 mRNA showed the same time course as transcripts of certain kinocilia-specific genes revealed. To study expression of pAK7 in tissues an antiserum against the C-terminal peptide of pAK7 was generated. Affinity and specificity of the antiserum to the antigen were shown by ELISA, immunocytochemical stainings of pAK7-expressing HEK cells and Western blots. In Western blots the intensity of the pAK7 signal could be optimised by application of partially purified antiserum. Using this antiserum for immuno stainings the pAK7 protein was detected intracellularly in cellcultures and tissue sections. Thereby the pAK7 protein could only be detected in kinocilia-bearing tissues. The putative adenylate kinase activity could not be verified in an adenylate kinase assay. Furthermore no interaction partners for pAK7 could be found with yeast two-hybrid system. The results of these multiple methods permit to name pAK7 an ependyma-specific protein only expressed in kinocilia-bearing tissues. pAK7 can thus be seen as a marker protein for this cell type in the brain. The physiological function of pAK7 could not be revealed in the present study. Coming research using RNAi or morpholino-substituted oligonucleotides shall give more information about the meaning of this protein e.g. for the generation of ciliary beating.