Effekte von Troglitazon und anderen Thiazolidindionen auf die Blutform von Trypanosoma brucei - Induktion der Differenzierung von slender-Formen

Abstract

Werden metazyklische Formen des Parasiten Trypanosoma brucei durch einen Stich der Tsetse-Fliege von deren Speicheldrüsen auf das Blut eines Vertebraten übertragen, so differenzieren sie sofort in Blutform-Parasiten, die als slender-Formen bezeichnet werden. Diese besitzen eine hohe Teilungsrate und sind für den Anstieg der Parasitämie verantwortlich. Haben sie eine gewisse Zelldichte im Blut ihres Wirts erreicht, so differenzieren sie in dickere, teilungsdefiziente Zellen, die stumpy-Formen. Diese Differenzierung verläuft transient über eine intermediäre Blutform. Während ihres Infektionsverlaufes produziert die Blutform mehrere Prostaglandin-Derivate, darunter auch Prostaglandin D2. Nach der Sezernierung durch die Parasiten wird dieses im Blut schnell zu Prostaglandinen der J-Serie wie 15-desoxy-PGJ2 metabolisiert, die alle einen Programmierten Zelltod in den Parasiten induzieren. Thiazolidindione besitzen das gleiche Targetprotein (PPARgamma) wie 15-desoxy-PGJ2, aber bei wesentlich höherer Affinität. Daher wurden die Effekte von Troglitazon, Ciglitazon und Rosiglitazon untersucht, um einen möglichen Mechanismus des Prostaglandin-induzierten Zelltodes aufzudecken. Alle Thiazolidindione führten unter Kulturbedingungen zu einer konzentrationsabhängigen Wachstumshemmung, wobei Troglitazon mit einer IC50 von 42 µM den stärksten Effekt zeigte (bei einer Plasmaproteinbindungsrate von 99%). Im Gegensatz zu den Prostaglandinen verursachten die Thiazolidindione jedoch keinen Zellzyklusarrest, Verlust des mitochondrialen Membranpotentials oder DNA-Degradierung, was mittels FACS-Analyse und Elektronenmikroskopie untersucht worden war. Neben Apoptose konnte auch Nekrose durch diese Methoden ausgeschlossen werden. Die vor allem durch Troglitazon induzierten Veränderungen umfassten hingegen eine Proliferation der Glykosomen als auch eine deutliche Weiterentwicklung des Mitochondriums. Dabei konnte die Steigerung der mitochondrialen Aktivität nach Behandlung der Zellen durch verschiedene Parameter wie Steigerung des mitochondrialen Membranpotentials, erhöhte Cyanosensitivität hinsichtlich des Sauerstoff-Verbrauchs und Aktivität der Succinatdehydrogenase bestätigt werden. Zudem konnten sich mit Troglitazon behandelte Blutformen aus der logarithmischen Wachstumsphase im Vergleich zu Kontrollzellen wesentlich besser und schneller zu prozyklischen Zellen entwickeln, wenn sie einem in vitro Transformationsprotokoll unterzogen wurden. Microarray-Analysen bestätigten die Ergebnisse dieser Versuche und zeigten eine schon fortgeschrittenere Differenzierung von slender Parasiten zu intermediären Formen, die im Gegensatz zu stumpy Formen jedoch nicht im Zellzyklus aufgelaufen sind. Begleitet waren diese Veränderungen beispielsweise durch eine Hochregulation von ESAG4, das für eine Adenylatzyklase kodiert. Diese könnte für die begleitende intrazelluläre Konzentrationserhöhung des cAMP bei der Differenzierung verantwortlich sein, da sie ausschließlich in Blutformen exprimiert wird. Am auffälligsten war jedoch eine Steigerung von ESAG8-Transkripten, einem potentiellen regulatorischen Protein, das seine Wirkung wahrscheinlich durch Interaktion mit anderen Proteinen entfaltet. Basierend auf diesen Ergebnissen lässt sich der bisher sehr rudimentär geklärte Differenzierungsmechanismus der Blutformen weiter untersuchen. Gleichzeitig wird die Rolle der stumpy-Formen für die Vollendung des Lebenszyklus in Frage gestellt. Vielmehr scheint eine Differenzierung zu intermediären Formen für eine Weiterentwicklung der Parasiten im Darm der Fliege zu prozyklischen Formen ausreichend zu sein. Die Bedeutung der zellzyklusarretierten stumpy-Formen läge dann eher in einer Zelldichteregulation im Blut des Wirtes, um eine längere Infektion und so die Wahrscheinlichkeit einer Wiederaufnahme durch die Fliege zu gewährleisten.

When metacyclic parasites enter the bloodstream of the vertebrate host, they differentiate immediately to slender bloodstream forms. They divide very rapidly and are responsible for the increase of the parasitemia. When they have reached a certain cell density, they change into stumpy forms which cease in proliferation. This differentiation is a transient process traversing an intermediate state already featured with the metabolism of the stumpy form, but morphologically difficult to determine. During the course of infection, the bloodstream form produces several prostaglandin-derivatives, among them prostaglandin D2. After releasing this substance into the bloodstream, it is rapidly metabolized in prostaglandins of the J-series like 15-deoxy-PGJ2, which finally induce a programmed cell death in the parasites. Thiazolidinediones share the target protein PPARgamma with 15-deoxy-PGJ2, but exhibit a much higher affinity. For this reason the effects of troglitazone, ciglitazone and rosiglitazone were used for further studies in order to discover a possible mechanism for the prostaglandin-effects. Under cultivation all thiazolidinediones lead to a concentration-dependent growth arrest. With an IC50 of 42 µM (and a plasma protein binding rate of 99%), troglitazone had the strongest effect on the cells. Nevertheless, in contrast to the prostaglandins, FACS-analyses and electron microscopy of thiazolidinedione-treated cells showed no sign of a cell cycle arrest, loss of mitochondrial membrane potential or DNA degradation. Beside apoptosis, necrosis also could be ruled out this way. The most obvious effects induced especially by troglitazone, were a proliferation of glycosomes and a further development of the mitochondrion. The mitochondrial activation following treatment could be confirmed by FACS-analysis, showing an increase of mitochondrial membrane potential, a raising cyano-sensitivity and a higher activity of succinate dehydrogenase. Additionally, troglitazone treated cells out of the logarithmic phase exhibited an extremely high ability to transform to procyclic parasites compared to the control cells, when they were object to an in vitro transformation protocol. Microarray analyses supported the results out of the other experiments and showed a further differentiation of the slender bloodstream form to an intermediate form which only differs from the stumpy form with regard to cell cycle arrest. This changes were accompanied e.g. by an up-regulation of ESAG4-transcripts, encoding an adenylyl cyclase. This protein could be responsible for the increase of the intracellular cAMP-concentration during the differentiation process, since ESAG4 is only expressed in the bloodstream form stage. The most striking up-regulation concerned a potential regulatory protein, ESAG8, which is thought to act via interactions with other proteins due to its structure. Based on these studies, the mechanism of bloodstream form differentiation which is only rudimentary solved, could be investigated further. Simultaneously the role of stumpy-forms for life cycle progression becomes questionable. Obviously a differentiation to an intermediate stage is sufficient for a development to procyclic parasites within the midgut of the tsetse-fly. The task of the cell cycle arrested stumpy forms would then rather be in regulation of cell density within the bloodstream, in order to ensure a longer survival of the mammalian host and an increasing likelihood of the parasites’ reuptake by another tsetse fly.