Untersuchungen zur Rolle molekularer Chaperone und Hitzeschockprotein-assoziierter Peptide in der T-Zell-vermittelten Immunantwort - Peptidmotiv und Liganden des Miniaturschwein-MHC I Moleküls PD1

Abstract

Hitzeschockproteine (HSP wie Gp96, Hsp70 u.a.) sind potente Stimulatoren des Immunsystems. Aufgrund phylogenetisch alter, hochkonservierter Strukturen ihres molekularen Aufbaus geht ihre Fähigkeit zur Immunstimulation über Speziesgrenzen hinaus, so daß für das menschliche Immunsystem sowohl mikrobielle als auch humane Hitzeschockproteine eine wichtige Rolle spielen. Neben einer unspezifischen, antigen-unabhängigen Aktivierung antigenpräsentierender Zellen über Rezeptoren der Toll-Familie (im wesentlichen TLR2 und TLR4) besitzen einige von ihnen die Fähigkeit, antigenspezifische Immunreaktionen auszulösen. Aus Tumorzellen isoliertes Gp96 z.B. löst, in Mäuse injiziert, die den gleichen spezifischen Tumortyp tragen, aus dem Gp96 zunächst isoliert wurde, eine für diesen Tumor spezifische Immunantwort aus. Durch zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) vermittelt und für zahlreiche Tumorarten nachgewiesen bildet diese Erkenntnis die Grundlage für neue therapeutische Strategien gegen menschliche Tumoren mit HSPs als Vakzine. Für die spezifische immunogene Wirkung der ansonsten zellunspezifischen HSPs werden endogene, nicht-kovalent an die HSPs gebundene Peptide verantwortlich gemacht, die über eine rezeptorvermittelte Endozytose des HSPs in den MHC I - Antigenprozessierungsweg antigenpräsentierender Zellen gelangen (sog. cross-presentation). Sie stellen ein Abbild des Peptidrepertoires der Tumorzelle dar, welches durch die tumorinduzierte Unterbrechung der zelleigenen Antigenprozessierung dem Immunsystem verborgen bleibt. Unschätzbarer Vorteil einer HSP-Vakzine ist also ihre Unabhängigkeit von der Kenntnis tumorspezifischer Antigene. Ungeachtet dieser vielversprechenden Mechanismen ist das Wissen um ihre molekularen und zellulären Grundlagen noch unvollständig. Unbekannt ist die Rolle MHC-Klasse II restringierter T-Helferzellen bei der durch das HSP Gp96 induzierten Immunantwort. In der vorliegenden Arbeit wird versucht, die Aktivierung MHC II-restringierter T-Zellen durch HSP-assoziierte Peptide nachzuweisen, entsprechende Versuchsgrundlagen werden geschaffen (nicht-radioaktiver Gp96-Beladungsassay), das Pro und Contra einer T-Zellhilfe wird diskutiert. Außerdem wird die Aktivierung humaner und muriner dendritischer Zellen durch Gp96 nachgewiesen und das resultierende Zytokinprofil bestimmt. In weiteren Versuchen wir die Bindung von humanem und chlamydialem Hsp60 an CD14+ Zellen und die Korrelation von CD14-Expression und Hsp60-Bindung an murinen dendritischen Zellen gezeigt. Zuletzt wird die Bestimmung zweier natürlicher Liganden des Miniatur-Schwein MHC-Moleküls PD1 gezeigt, die eine wichtige Bedeutung für Studien zur Antigenprozessierung xenogener Proteine und damit verbundener Abstoßungsreaktionen haben.

Heat-shock proteins (Gp96, Hsp70 and others) are potent stimulators of the immune system. Due to their phylogenetically old, highly conserved structure, the stimulatory properties of heat-shock proteins are effective across species barriers. Therefore, heat-shock proteins of human and microbial origin play an important role for the human immune system. Apart from an unspecific, antigen-independent activation of antigen presentig cells (APC) via receptors of the toll-like family (mainly TLR2 and TLR4), some heat-shock proteins have the ability to mediate an antigen-specific immune response. For example, Gp96 isolated from murine tumor-cells induces, when injected in the mouse originally bearing the tumor, an immune response specific for that particular tumor. This phenomenon is mainly mediated by cyctotoxic T-lymphocytes and has been shown for several types of tumor. It forms the basis for new therapeutic strategies against human tumors using heat-shock proteins as vaccines. Endogenous, non-covalently bound peptides have been identified as principal inducers of this specific immune response mediated by otherwise cell-type-unspecific heat shock proteins. Following uptake by APC via receptor-mediated endocytosis, these peptides bound to heat shock proteins are transferred into the MHC-class I processing pathway (‘cross presentation’). They represent an image of the peptide repertoire present in the cancerous cell, which usually remains invisible to the immune system due to tumor-induced interruption of antigen presentation. Therefore, the independence of the identification of specific tumor antigens is the greatest advantage of a vaccine based on heat-shock proteins. Despite of these promising properties of heat-shock proteins, the underlying molecular and cellular mechanisms remain yet to be elucidated. Especially the role of MHC class II restricted T-cells in the Gp96-mediated immune response is unknown. The work presented here tries to show the activation of MHC class II restricted T-cells by Hsp-associated peptides. The necessary experimental basis is created (non-radioactive Gp96 loading assay) and the pros and cons of a T-cell help are discussed. In addition, the activation of human and murine dendritic cells by Gp96 is shown as well as the identification of the resulting cytokine profile. In further experiments, the binding of human and chlamydial Hsp60 to CD14+ cells and the correlation of CD14-expression of, and Hsp60-binding to murine dendritic cells is presented. Finally, the identification of two natural ligands of the miniature swine MHC-class I molecule PD1 is shown. These ligands have an important implication for further studies targeting antigen processing of xenogeneic proteins and associated graft rejections.