A multi-omics study investigating the responses of Bacillus subtilis to the antibiotic fosfomycin and the development of cell wall analysis methods

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 16. September 2026 !

Die derzeitige Zunahme antimikrobieller Resistenzen und der alarmierende Mangel an neuen Antibiotika in klinischen Studien erfordern eine Neubewertung bestehender Antibiotika für therapeutische Anwendungen, um den aktuellen medizinischen Standard aufrechtzuerhalten. Fosfomycin (FOS) ist ein seit langem etabliertes Antibiotikum mit einem breiten Wirkungsspektrum gegen grampositive und gramnegative Bakterien. Durch synergistische Effekte mit Antibiotika aus verschiedenen Klassen bietet es ungenutztes Potenzial für Kombinationstherapien, auch gegen multiresistente Erreger. Die Untersuchung der zellulären Antworten von Bakterien ermöglicht ein tieferes Verständnis der FOS-induzierten bakteriellen Reaktionen, die über die Hemmung des Zielmoleküls MurA hinausgehen. Dies bildet die Grundlage für medizinische Kombinationstherapien. Dazu wurde das Wachstumsverhalten des probiotischen grampositiven Modellbakteriums Bacillus subtilis in Gegenwart verschiedener FOS-Konzentrationen mittels Multi-Omics Analysen untersucht. Durch die Hemmung des Enzyms MurA, das den ersten Schritt der de novo Peptidoglykan (PGN) Biosynthese darstellt, greift FOS in einen streng regulierten und essenziellen bakteriellen Stoffwechselweg ein. MurA katalysiert die Enolpyruvyl Übertragung von Phosphoenolpyruvat (PEP) auf UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc), wodurch UDP-GlcNAc-Enolpyruvat entsteht. FOS hemmt MurA kovalent durch Bindung an einen Cysteinrest im aktiven Zentrum des Enzyms. Interessanterweise wird das native MurA-Enzym in Gegenwart von PEP an diesem Cysteinrest kovalent modifiziert, wodurch es vor einem Angriff durch FOS geschützt ist. Die posttranslationale Modifikation durch PEP konnte bisher nicht direkt nachgewiesen werden, obwohl bereits existierende Kristallstrukturen von MurA darauf hindeuten. Mittels nativer MS konnte die kovalente Bindung von PEP an beide MurA-Isoformen in B. subtilis (MurAA und MurAB) direkt nachgewiesen und der daraus resultierende Schutz vor FOS bestätigt werden. Die Bedeutung des Glycerin-3-Phosphat-Transporters GlpT für die Aufnahme von FOS und der Bacillithiol-S-Transferase FosB für die Entgiftung von FOS wurde durch chromosomale Mutanten nachgewiesen. In einem Multi-Omics Ansatz, bestehend aus Transkriptom-, Proteom- und Metabolom-Untersuchungen, wurden die metabolischen Anpassungen durch die Verwendung niedrigerer FOS-Konzentrationen und die Ursachen der Zelllyse in Gegenwart höherer FOS-Konzentrationen umfassend analysiert. Die Ergebnisse zeigten sowohl spezifische stressabhängige Reaktionen als auch stressunabhängige metabolische Anpassungen in FOS-behandelten Zellen. Zellhüllenstress, der durch die alternativen Sigma-Faktoren SigM, V, W, X, Y und den Transkriptionsregulator Spx kontrolliert wird, dominierte die Antwort. Auffallend ist, dass auch die Lipoteichonsäure-, Teichosäure- und Fettsäuresynthese sowie die Eisenhomöostase hochreguliert waren. Die PGN-Synthese war hochreguliert, während PGN abbauenden Enzyme herunterreguliert waren. Insgesamt regulierte FOS die katabolen Prozesse der Zelle herunter. Um FOS-induzierte Metabolitveränderungen zu untersuchen, wurde ein LC-MS Metabolomics Arbeitsablauf mit Schwerpunkt auf der Zellwandanalyse unter Verwendung einer Standardbibliothek entwickelt, die alle löslichen PGN-Vorstufen enthält. Darüber hinaus wurden LC-MS- und HPLC-Analysen entwickelt und eingesetzt, um Fragestellungen im Zusammenhang mit der Wirkung von FOS, der bakteriellen Zellwand und dem Zuckerstoffwechsel in verschiedenen Projekten zu beantworten. Die vorgestellte Arbeit ermöglicht ein differenziertes Verständnis der komplexen zellulären Reaktionen auf FOS und liefert wertvolle neue Erkenntnisse über das Zusammenspiel von Wachstumshemmung, Zelllyse und metabolischer Anpassung unter FOS-Behandlung. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zu einem umfassenderen Verstehen bei, wie flexibel Bakterien ihren Stoffwechsel unter antibiotischen Stressbedingungen anpassen und erweitern das Wissen im Umgang mit antimikrobiellen Resistenzen.

The rising antimicrobial resistance and a critical shortage of new antibiotics in clinical trials are forcing a re-evaluation of existing drugs for innovative antibiotic therapeutic applications to ensure current standards of infection control. Fosfomycin (FOS) is a long-established antibiotic with broad-spectrum activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria, offering untapped potential for antibacterial therapy, including the containment of multidrug-resistant pathogens, due to its synergistic effects when combined with antibiotics from different classes. A detailed study of the cellular responses to FOS is hypothesised to enhance the understanding of FOS-induced bacterial responses beyond the inhibition of the target MurA, thereby rationalising the development of combination therapies. The probiotic Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis was used to re-evaluate target inhibition, investigate growth behaviour in the presence of different FOS concentrations and study cellular responses using multi-omics. FOS targets a tightly regulated and generally essential bacterial pathway by blocking the enzyme MurA, which catalyses the first committed step in de novo peptidoglycan (PGN) biosynthesis. MurA is a unique enzyme that catalyses the enolpyruvyl transfer of phosphoenolpyruvate (PEP) to UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) to form UDPGlcNAc- enolpyruvate. FOS covalently inhibits MurA by binding to a cysteine residue in the active site of the enzyme. Interestingly, in the presence of PEP, the native MurA enzyme is covalently modified at this cysteine residue, protecting it from the attack of FOS. Although MurA crystal structures suggested this post-translational PEP modification, it had not been directly demonstrated. Native protein MS was used to reveal covalent PEP binding to both MurA isoforms present in B. subtilis (MurAA and MurAB) and to confirm the resulting protection against FOS. The importance of the glycerol-3-phosphate transporter GlpT for FOS uptake and the bacillithiol S-transferase FosB for FOS detoxification was demonstrated using chromosomal mutants that were at least five times more sensitive to the antibiotic. To understand the metabolic adaptations induced by lower FOS levels that confer tolerance to the antibiotic and the causes of cell lysis in the presence of higher FOS levels, the FOS-induced responses of B. subtilis were investigated using a comprehensive multi-omics approach, including transcriptomics, proteomics and metabolomics. The results revealed specific stressinduced responses as well as stress-independent metabolic adaptations in FOS-treated cells. Cell envelope stress, controlled by the alternative sigma factors SigM, V, W, X, Y and the transcriptional regulator Spx, dominates the response to high concentrations of FOS. Interestingly, lipoteichoic acid, teichoic acid and fatty acid synthesis were upregulated under these conditions, along with iron homeostasis. PGN associated hits were affected in different ways: Synthesis was upregulated and degradation enzymes were downregulated. Overall, FOS downregulates catabolic processes. Furthermore, an LC-MS-based cell wall metabolomics workflow was developed to monitor FOS-induced metabolite changes by semiautomated comparison with a standard library containing all soluble precursors of PGN synthesis. Analyses of bacterial metabolites were performed in the context of PGN and beyond. In addition, LC-MS and HPLC analyses were developed and applied to address a wide range of questions related to FOS action, cell wall and sugar metabolism. The study provides a nuanced understanding of the complex cellular responses to FOS and provides valuable new insights into the interplay between growth inhibition, cell lysis and metabolic adaptation under FOS treatment. The results contribute to a more comprehensive understanding of bacterial metabolic adaptation under antibiotic stress, advancing knowledge in the fight against antimicrobial resistance and antibiotic use.