| dc.description.abstract |
In der Immunonkologie wurde neben den Immuncheckpoint-Inhibitoren und den bispezifischen
Antikörpern in den letzten Jahren viel an den zellulären Immuntherapien geforscht. Etabliert
sind mittlerweile diverse Therapien. Beim therapierefraktären B-Zell-Lymphom sind z.B. die
zwei CAR-T-Zell-Therapien mit Axicabtagen-Ciloleucel und Tisagenlecleucel von der
europäischen Zulassungsbehörde freigegeben und weisen Erfolge im Therapieverlauf auf.
Leider sind derartige Therapien mit immensen Kosten und großem Aufwand verbunden. Die
Produktion der CAR-T-Zellen nehmen einige Tage in Anspruch, da die patienteneigenen T
Zellen zunächst vom Patienten extrahiert werden müssen, in verschiedenen Schritten mit dem
CAR versehen werden und anschließend stimuliert werden müssen. Bisher werden Lentiviren,
hergestellt, die das Gen, kodierend für den CAR, beinhalten und anschließend das Gen in die
isolierten T-Zellen ex vivo transduzieren. Die Herstellung der Lentiviren erfolgt mittels
Transfektion. Um die effizienteste Transfektionsmethode zu evaluieren, wurden im ersten Teil
dieser Arbeit verschiedene Transfektionsverfahren verglichen. Es erfolgte der Vergleich der
Calciumphosphat-Präzipitation sowohl als Kit, als auch selbst hergestellt. Weiterhin wurde die
Effizienz der Transfektion mittels LipofectamineTM2000, LipofectamineTM3000, als auch
Polyethylenimin evaluiert. Es zeigte sich, dass LipofectamineTM3000 die effizienteste Methode
ist, um eine hohe Rate an Transfektion zu erhalten. Vor diesem Hintergrund baute sich der
zweite Teil dieser Arbeit auf, indem die für die weiteren CAR-T-Zell-Produktion
LipofectamineTM3000 verwendet wurde.
Die CARs selbst – sofern bereits hergestellt – beschränken sich mit ihrer therapeutischen
Wirksamkeit nur auf das für sie spezifische Antigen und somit auf eine therapeutische
Indikation. Um diese Limitation zu überwinden, wurden von Christian Seitz et. al. der AdCAR
entwickelt. Ein Adapter-CAR, der nicht gegen ein spezifisches Antigen gerichtet ist, sondern
gegen Biotin. Durch Zugabe von Antikörpern, gerichtet gegen gewünschte Antigene, die
zusätzlich Biotin enthalten, wirken diese als Adapter. Die Antikörper binden an die
gewünschten Antigene an der Tumorzelle und präsentieren Biotin. Die AdCAR-T-Zelle erkennt
das Biotinlabel und bindet somit über den Antikörper an die Tumorzelle. Somit kann die
Limitation der Indikation überwunden werden. Neben der Indikationsbeschränkung bestehen
weitere Limitationen wie z.B. die der allogenen Anwendungen. Werden T-Zellen von Patienten
isoliert und ex vivo mit AdCARs versehen, ist eine autologe Verwendung problemlos. Bei
allogenen Verwendungen besteht die Gefahr der GvHR durch den endogenen TCR, der initial
bereits auf den T-Zellen vorlag. Um die Limitation der drohenden GvHR zu überwinden,
beschäftigt sich der zweite Teil dieser Arbeit. Ziel war es das Gen, codierend für den endogenen
TCR mittels CRISPR/Cas9 auszuschalten, damit der endogene TCR nicht mehr produziert
werden kann und somit keine GvHR ausgelöst werden kann. Als Vorlage wurde die
Veröffentlichung von Jensen et. al. verwendet, die den KO bereits an anderen CAR-T-Zellen
zeigen konnten und in dieser Arbeit auf die AdCAR-T-Zellen übertragen. Als Vorversuch
erfolgte der KO auf Jurkat-Zellen, die sich dadurch charakterisieren, einen endogenen TCR zu
besitzen und leicht anzuzüchten sind. Durch Adressieren der alpha-Kette des endogenen TCR
mittels Guide-RNA konnte ein Doppelstrangbruch erzeugt werden. Im Anschluss wurde
sowohl in der Durchflusszytometrie das Fehlen der endogenen TCRs, als auch auf genetischer
Ebene mittels T7-Endonuklease-I Assay der Nachweis der Doppelstrangbrüche gezeigt. Im
Anschluss erfolgte das gleiche Verfahren im Anschluss mit den Ad-CAR-T-Zellen. Hierbei
konnte ebenfalls ein erfolgreicher KO des Gens sowohl in der Durchflusszytometrie als auch
auf genetischer Ebene gezeigt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass ein gezielter KO des Gens,
kodierend für die alpha-Kette des endogenen TCR dazu führt, dass dieser nicht mehr auf der
Zelloberfläche exprimiert werden kann und somit ein wichtiger Faktor für eine drohende GvHR
eliminiert werden kann. |
de_DE |
