Verbesserung der klinischen Anwendbarkeit von AdCAR-T Zellen

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Zitierfähiger Link (URI): http://hdl.handle.net/10900/157686
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-1576861
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-99018
Dokumentart: Dissertation
Erscheinungsdatum: 2024-09-24
Sprache: Deutsch
Fakultät: 4 Medizinische Fakultät
Fachbereich: Medizin
Gutachter: Huber, Stephan (Prof. Dr.)
Tag der mündl. Prüfung: 2024-07-19
DDC-Klassifikation: 500 - Naturwissenschaften
610 - Medizin, Gesundheit
Freie Schlagwörter: AdCAR
CRISPR
Transfektion
Lizenz: http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=de http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=en
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Inhaltszusammenfassung:

In der Immunonkologie wurde neben den Immuncheckpoint-Inhibitoren und den bispezifischen Antikörpern in den letzten Jahren viel an den zellulären Immuntherapien geforscht. Etabliert sind mittlerweile diverse Therapien. Beim therapierefraktären B-Zell-Lymphom sind z.B. die zwei CAR-T-Zell-Therapien mit Axicabtagen-Ciloleucel und Tisagenlecleucel von der europäischen Zulassungsbehörde freigegeben und weisen Erfolge im Therapieverlauf auf. Leider sind derartige Therapien mit immensen Kosten und großem Aufwand verbunden. Die Produktion der CAR-T-Zellen nehmen einige Tage in Anspruch, da die patienteneigenen T Zellen zunächst vom Patienten extrahiert werden müssen, in verschiedenen Schritten mit dem CAR versehen werden und anschließend stimuliert werden müssen. Bisher werden Lentiviren, hergestellt, die das Gen, kodierend für den CAR, beinhalten und anschließend das Gen in die isolierten T-Zellen ex vivo transduzieren. Die Herstellung der Lentiviren erfolgt mittels Transfektion. Um die effizienteste Transfektionsmethode zu evaluieren, wurden im ersten Teil dieser Arbeit verschiedene Transfektionsverfahren verglichen. Es erfolgte der Vergleich der Calciumphosphat-Präzipitation sowohl als Kit, als auch selbst hergestellt. Weiterhin wurde die Effizienz der Transfektion mittels LipofectamineTM2000, LipofectamineTM3000, als auch Polyethylenimin evaluiert. Es zeigte sich, dass LipofectamineTM3000 die effizienteste Methode ist, um eine hohe Rate an Transfektion zu erhalten. Vor diesem Hintergrund baute sich der zweite Teil dieser Arbeit auf, indem die für die weiteren CAR-T-Zell-Produktion LipofectamineTM3000 verwendet wurde. Die CARs selbst – sofern bereits hergestellt – beschränken sich mit ihrer therapeutischen Wirksamkeit nur auf das für sie spezifische Antigen und somit auf eine therapeutische Indikation. Um diese Limitation zu überwinden, wurden von Christian Seitz et. al. der AdCAR entwickelt. Ein Adapter-CAR, der nicht gegen ein spezifisches Antigen gerichtet ist, sondern gegen Biotin. Durch Zugabe von Antikörpern, gerichtet gegen gewünschte Antigene, die zusätzlich Biotin enthalten, wirken diese als Adapter. Die Antikörper binden an die gewünschten Antigene an der Tumorzelle und präsentieren Biotin. Die AdCAR-T-Zelle erkennt das Biotinlabel und bindet somit über den Antikörper an die Tumorzelle. Somit kann die Limitation der Indikation überwunden werden. Neben der Indikationsbeschränkung bestehen weitere Limitationen wie z.B. die der allogenen Anwendungen. Werden T-Zellen von Patienten isoliert und ex vivo mit AdCARs versehen, ist eine autologe Verwendung problemlos. Bei allogenen Verwendungen besteht die Gefahr der GvHR durch den endogenen TCR, der initial bereits auf den T-Zellen vorlag. Um die Limitation der drohenden GvHR zu überwinden, beschäftigt sich der zweite Teil dieser Arbeit. Ziel war es das Gen, codierend für den endogenen TCR mittels CRISPR/Cas9 auszuschalten, damit der endogene TCR nicht mehr produziert werden kann und somit keine GvHR ausgelöst werden kann. Als Vorlage wurde die Veröffentlichung von Jensen et. al. verwendet, die den KO bereits an anderen CAR-T-Zellen zeigen konnten und in dieser Arbeit auf die AdCAR-T-Zellen übertragen. Als Vorversuch erfolgte der KO auf Jurkat-Zellen, die sich dadurch charakterisieren, einen endogenen TCR zu besitzen und leicht anzuzüchten sind. Durch Adressieren der alpha-Kette des endogenen TCR mittels Guide-RNA konnte ein Doppelstrangbruch erzeugt werden. Im Anschluss wurde sowohl in der Durchflusszytometrie das Fehlen der endogenen TCRs, als auch auf genetischer Ebene mittels T7-Endonuklease-I Assay der Nachweis der Doppelstrangbrüche gezeigt. Im Anschluss erfolgte das gleiche Verfahren im Anschluss mit den Ad-CAR-T-Zellen. Hierbei konnte ebenfalls ein erfolgreicher KO des Gens sowohl in der Durchflusszytometrie als auch auf genetischer Ebene gezeigt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass ein gezielter KO des Gens, kodierend für die alpha-Kette des endogenen TCR dazu führt, dass dieser nicht mehr auf der Zelloberfläche exprimiert werden kann und somit ein wichtiger Faktor für eine drohende GvHR eliminiert werden kann.

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