Design and Synthesis of Covalent Inhibitors for the Protein Kinase MK2 and Exploration of Different Cysteine-Targeting Electrophiles

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 23. Juni 2026 !

The protein kinase MK2 (mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2) belongs to the effector proteins of the p38 MAP kinase signaling pathway and plays an important role in the regulation of inflammatory processes. Furthermore, recent findings show the involvement of MK2 in carcinogenesis and tumor progression. These properties render the kinase an interesting target in drug discovery. In this work, a covalent design approach was pursued for the development of new inhibitors against the protein kinase MK2. The application of covalent protein kinase inhibitors enables an improvement in activity, selectivity and extends the duration of action. Furthermore, the successful covalent binding of the inhibitor prevents its displacement by ATP, the physiological cosubstrate of the kinase. The covalent bond is formed by the reaction of an electrophilic group, the so-called warhead of the inhibitor, with a nucleophilic center in the protein, usually an amino acid side chain. Cysteine residues display attractive target structures for covalent targeting due to the high nucleophilicity of the thiol group located in the side chain and the low degree of conservation in the kinome. Typically, the development of covalent kinase inhibitors requires the presence of a cysteine in or in proximity to the ATP binding pocket. With Cys140, the protein kinase MK2 possesses such an addressable cysteine in the hinge region. An equivalently positioned cysteine residue is also found in four other kinases, FGFR4, MPS1, S6K2 and MK3, which also offers the possibility of improving selectivity via the covalent approach. The combination of a known, reversible binding, tetracyclic MK2 inhibitor with an electrophilic warhead represents the initial design approach of this work. The optimization of the synthesis of the core scaffold, modification thereof to improve synthetic accessibility and derivatization possibilities enabled the synthesis of various analogues. In addition to established acrylamide-based warheads, heteroaromatic electrophiles could also be successfully incorporated as reactive groups. Both acrylamide-based derivatives and those based on a chloronitropyridine showed very good inhibitory activity in the biochemical assay, as well as low intrinsic reactivity towards surrogate nucleophiles. The successful covalent targeting was further confirmed through intact protein mass spectrometric and X-ray crystallography.

Die Proteinkinase MK2 (mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2) gehört zu den Effektorproteinen des p38 MAP-Kinase Signalwegs und spielt eine wichtige Rolle in der Entstehung von Entzündungsreaktionen. Darüber hinaus zeigen neuere Erkenntnisse, dass MK2 an der Krebsentstehung und Tumorprogression beteiligt ist. Diese Eigenschaften machen die Kinase zu einem interessanten Arzneistofftarget. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein kovalenter Designansatz zur Entwicklung neuer Inhibitoren der Proteinkinase MK2 verfolgt. Der Einsatz kovalenter Proteinkinaseinhibitoren ermöglicht eine Verbesserung der Aktivität, Selektivität und Verlängerung der Wirkdauer. Des Weiteren verhindert die erfolgreiche kovalente Bindung des Inhibitors dessen Verdrängung durch ATP, dem physiologischen Cosubstrat der Kinase. Die Ausbildung der kovalenten Bindung erfolgt dabei durch die Reaktion eines elektrophilen Strukturelements, dem sogenannten warhead des Inhibitors mit einem nucleophilen Zentrum im Protein, meist einer Aminosäuren-Seitenkette. Die hohe Nucleophilie der Thiolgruppe der Seitenkette der Aminosäure Cystein und der geringe Grad der Konservierung von Cysteinen im Kinom, machen diese zu attraktiven Zielstrukturen für kovalente Inhibitoren. Typischerweise setzt die Entwicklung kovalenter Kinaseinhibitoren die Anwesenheit eines Cysteins in bzw. in der Nähe der ATP-Bindungstasche voraus. Mit Cystein-140 besitzt die Proteinkinase MK2 ein solches adressierbares Cystein in der hinge-Region. Ein äquivalent positionierter Cysteinrest findet sich leidglich in vier weiteren Kinasen, FGFR4, MPS1, S6K2 und MK3, wodurch sich über die kovalente Adressierung auch eine Möglichkeit zur Verbesserung der Selektivität bietet. Die Kombination eines bekannten, nicht-kovalent bindenden, tetracyclischen MK2 Inhibitors mit einem elektrophilen warhead stellt den initialen Designansatz dieser Arbeit dar. Die Optimierung der Synthese der Gerüststruktur, deren Modifikation zur Verbesserung der synthetischen Zugänglichkeit und Vereinfachung der Derivatisierung ermöglichte die Synthese diverser Analoga. Neben etablierten Acrylamid-basierten reaktiven Gruppen, konnten auch heteroaromatische Elektrophile erfolgreich als warhead-Strukturen eingebaut werden. Dabei zeigten sowohl Acrylamid-basierte Derivate als auch solche, die auf einem Chlornitropyridin beruhen, sehr gute inhibitorische Aktivität im biochemischen Assay, sowie geringe intrinsische Reaktivität gegenüber Surrogatnucleophilen. Die erfolgreiche kovalente Adressierung konnte weiterhin durch, im Rahmen einer Kooperation erfolgte, massenspektrometrische Analyse des Inhibitor-gebundenen Proteins und Röntgenkristallstrukturuntersuchungen bestätigt werden.