Entwicklung eines in-vitro 3D-Modells der Plaqueentstehung bei Atherosklerose für die Untersuchung siRNA oder mRNA basierter therapeutischer Ansätze

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein in-vitro 3D-Modell zu entwickeln, das bei der Plaqueentstehung im Zuge der Atherosklerose für die Untersuchung von siRNA oder mRNA basierter therapeutischer Ansätze herangezogen werden kann. Zu Beginn wurden sowohl Endothelzellen als auch glatte vaskuläre Muskelzellen aus Resten von Spendervenenstücken von Patienten aus der Chirurgie isoliert und mittels Fluoreszenzmikroskopie und FACS charakterisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass das bereits aus der Literatur bekannte Protokoll für EC-Isolierung funktioniert und die ECs mittels des Markers CD31 für das jeweilige Verfahren bestätigt werden konnten. Zur Auswertung der VSMCs wurden die Marker CD90, Alpha-Actin verwendet. Über die Fluoreszenzmikroskopie als auch über die Ergebnisse des FACS ist davon auszugehen, dass es sich nicht eindeutig um VSMCs handelt. Die hohe Anzahl an CD90 positiven Zellen, deutet vielmehr auf Fibroblasten hin. Das Protokoll zur makroskopischen Isolierung von VSMCs stellte sich als nicht ausreichend heraus. Daraus abgeleitet, wurden hTERT-VSMCs von der Firma abm® eingekauft. Anschließend wurde der Prototyp mittels des Gewebeklebers Beriplast® und den hTERT-VSMCs angesetzt. Das Ziel war es eine mehrschichtige, einheitliche Besiedlung zu bewirken, auf die abschließend Endothelzellen angesiedelt werden konnten. Parallel dazu wurden MM6 angezüchtet. Darauffolgend wurden die Zellen entsprechend des von uns formulierten Versuchsaufbaus „ohne TNFα, ohne MM6“, „mit TNFα, ohne MM6“, „mit TNFα, mit MM6“, „mit TNFα, mit MM6, mit SCR-siRNA“, „mit TNFα, mit MM6, mit EIV“ transfiziert und die MM6 ausgesät. Abschließend wurde die qRT-PCR zur Messung der Genexpression mit den Markern CD 14, 45, 68, Cx 43, E-Selektin, ICAM-1, VCAM-1, IL-8 und PECAM-1 in Bezug auf das Referenzgen GAPDH-ausgewertet. Das Ergebnis hat gezeigt, dass die Tendenz des Knockdowns über die verwendeten siRNAs erreicht werden kann, so dass nicht vermehrt MM6 Zellen an der Oberfläche des Prototypens adhärieren. Allerdings zeigte sich die hier verwendete SCR-siRNA nicht wie beabsichtigt als Negativprobe, sondern in fast allen Fällen wurde eine erhöhte Genexpression gemessen.