Development of peptide-based ligands for acetyllysine binding modules and proteomic profiling of N-terminal acetyltransferases

Abstract

Die Dissertation ist bis zum 14. November 2025 gesperrt !

Acetylation is one of the major co- and posttranslational protein modifications in the cell. Acetyl groups can be installed on the amino groups of the N-terminal (Nt) residues or lysine side chains of proteins by N-terminal acetyltransferases (NATs) and lysine acetyltransferases (KATs), respectively. In chromatin, acetylated lysines of histones can convey epigenetic signals by recruiting bromodomain (Brd)-containing proteins (BRDs). BRDs can serve as transcriptional regulators and dysfunctions of these proteins is associated with the development of cancer. Consequently, small molecule ligands that bind BRDs have been developed for blocking oncogenic recruitment of chromatin factors. A recently invented non-natural amino acid 2-amino(3-methyl-1,2,4-triazole)pimelic acid (ApmTri) allows establishing a new class of peptide-based BRD ligands, broadening the biochemical toolbox and allowing to explore possible medical applications. In this thesis, peptide-based ligands for each of the two Brds of BRD3 and BRD4 were developed by optimizing amino acid sequences of known Brd binding sites. Synthetic peptide libraries generated by the SPOT-approach in combination with ApmTri were used for this process. These experiments revealed optimized ligand sequences that exhibited superior Brd interactions in comparison to the native binding site in pulldown experiments. Stability optimization allowed for incorporation of N-methylated and d-amino acids into the sequence without major impact on Brd recruitment. In order to address both Brds of BRD3 and BRD4 simultaneously, optimized binding probes for both Brds were combined in a bivalent ligand construct that interacts efficiently with the full-length proteins. Finally, a set of five cell-penetrating peptides was provided to ultimately enable cellular uptake of the bivalent peptide ligands. The second part of this thesis was focused on peptide probes for NATs. Malfunction of these enzymes is known to perturb protein homeostasis by altered N-terminal acetylation, resulting in hereditary diseases. A set of two CoA-peptide conjugates serving as bisubstrate NAT inhibitors were synthesized. High resolution LC-MS/MS analyses of interaction of said probes uncovered a distinct impact of the N-terminal residue on NAT recruitment from HeLa lysate resembling the specificity of these enzymes. The experiments further confirmed a switch in substrate specificity of NAA10 that depended on presence or absence of NAA10 binding partners.

Acetylierung ist eine der häufigsten Proteinmodifikationen in der Zelle. Die Acetylgruppe kann durch N-terminale (Nt) Acetyltransferasen (NATs) an die N- -Gruppe des Protein-NTerminus oder durch Lysin Acetyltransferasen an die N-"-Gruppe von Lysinen angelagert werden. Im Chromatin können acetylierte Lysine in Histonen epigenetische Signale vermitteln, indem sie Bromodomain (Brd)-haltige Proteine (BRDs) rekrutieren. Diese BRDs können die Transkription regulieren, und Funktionsstörungen dieser Proteine werden mit der Entstehung von Krebs in Verbindung gebracht. Infolgedessen wurden kleine Molekülliganden entwickelt, die BRDs binden, um die onkogene Rekrutierung von Chromatinfaktoren zu blockieren. Die kürzliche Entwicklung der nicht-natürlichen Aminosäure 2-amino(3-methyl- 1,2,4-triazole)pimelic acid (ApmTri) ermöglicht eine neue Klasse von peptidbasierten BRD Inhibitoren, welche den biochemischen Werkzeugkasten erweitern und den Weg für medizinische Anwendungen eröffnen. In dieser Arbeit wurden peptidbasierte Inhibitoren für beide Brds von BRD3 und BRD4 entwickelt, indem die Aminosäuresequenzen bekannter Brd Bindungsstellen optimiert wurden. Für diesen Prozess wurden synthetische Peptidbibliotheken verwendet, die mit dem SPOT-Ansatz in Kombination mit ApmTri generiert wurden. Diese Experimente ergaben optimierte Sequenzen, die im Vergleich zu nativen Substraten in Pulldown-Experimenten eine bessere Interaktion zeigten. Zur Stabilitätserhöhung wurden N-methylierte und d- Aminosäuren in die Sequenz eingefügt, ohne die Affinität stark zu mindern. Um beide Brds von BRD3 und BRD4 gleichzeitig zu adressieren wurden optimierte Sonden für beide Brds zu einem bivalenten Liganden kombiniert, welcher effizient mit den Volllängenproteinen interagiert. Abschließend wurden fünf zellpenetrierende Peptide (CPPs) synthetisiert, um die Aufnahme der bivalenten Peptidliganden in die Zellen zu ermöglichen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit Peptidsonden für NATs. Eine Funktionsstörung der NATs kann die Proteinhomöostase durch veränderte Nt-Acetylierung deregulieren, was zu Erbkrankheiten führen kann. Es wurden zwei CoA-Peptid-Konjugate synthetisiert, die als Bisubstrat-NAT-Inhibitoren dienen. Hochauflösende LC-MS/MSAnalysen der Interaktion dieser Sonden ergaben einen deutlichen Einfluss des N-terminalen Restes auf die NAT-Rekrutierung aus HeLa-Lysat entsprechend der Spezifität dieser Enzyme. Die Experimente bestätigten außerdem einen Wechsel in der Substratspezifität von NAA10, welcher von der Anwesenheit oder Abwesenheit von NAA10-Bindungspartnern abhängt.