Funktionelle Charakterisierung der beiden hepatischen organischen Anionentransporter OAT2 (SLC22A7) und OAT7 (SLC22A9) mittels in vitro Methoden und zwei neu generierten Mausmodellen

Abstract

Membrane transporters mediate the transport of various endogenous as well as exogenous substances across the cell membrane and are therefore not only essential players in homeostasis but also in the adsorption, distribution, metabolism and excretion of drugs. Therefore, functional characterization of membrane transporters is crucial in order to understand their physiological function and to avoid severe side effects or therapeutic failure of administered drugs. The organic anion transporters 2 and 7 (OAT2, SLC22A7 and OAT7, SLC22A9) enable the transport of organic anions across the cell membrane and are only poorly characterized so far. Both transporters are expressed in the sinusoidal membrane of hepatocytes and OAT2 can also be found in proximal tubule cells of the kidneys. For OAT7 only few substrates have been identified so far and although there are several endogenous and exogenous substrates known for OAT2, the physiological as well as the pharmacological roles of both transporters remain unclear. The aim of this work therefore was to functionally characterize OAT2 and OAT7 with the help of transporter-expressing cell lines as well as with two novel transgenic mouse models. Cell lines stably expressing human OAT2 and its mouse orthologue mOat2, hOAT7 as well as other relevant hepatic sinusoidal uptake transporters were used to investigate the transport function of OAT2 and OAT7 with in vitro experiments. Transport of the second messenger cGMP through hOAT2 has already been described before and could be confirmed in this study. Furthermore, we could show that mOat2 as well is able to transport cGMP. The cGMP transport function was extensively characterized for human and mouse OAT2 with a special focus on species-specific differences. We could additionally show that hOAT2 is the only one of the most relevant hepatic sinusoidal drug uptake transporters capable of transporting cGMP, suggesting an important role of hOAT2 in cGMP signaling and therefore in various physiological processes. The transport of xanthine, an intermediate product of purine degradation, through hOAT2 has also been described before and was shown to be time- and concentration-dependent for the first time in this work. Furthermore, as for cGMP, we were able to show that hOAT2 is the only one of the most relevant hepatic sinusoidal drug uptake transporters able to transport xanthine. Additionally, we showed that xanthine is not a substrate of mOat2. We were also able to identify a new substrate class of OAT2. Different pterines that have important functions in various physiological processes, for example as cofactors for enzyme function, were identified as substrates of hOAT2 and mOat2. As seen for cGMP and xanthine, we found species-specific differences in substrate specificity and transport function between human and mouse OAT2. The hOAT2-mediated transport of neopterin, an important player in the immune system, was further characterized. To elucidate the physiological role of OAT2 and OAT7 and to further characterize the two transporters, we generated on the one hand a mOat2 knockout and on the other hand a hepatocyte-specific hOAT7 knockin mouse model and tested the applicability of the animals for the investigation of the two membrane transporters. mOat2 knockout as well as hOAT7 knockin mice were healthy and did not show any phenotypic abnormalities. Liver histology and clinical chemistry were comparable to wildtype control mice. With extensive characterization on DNA, RNA and protein level using various molecular biology techniques like qPCR, immunoblotting and immunohistochemical staining, we could show that mice of the two lines actually showed missing expression of mOat2 or liver-specific expression of hOAT7 as expected. Genomwide gene expression analyses revealed altered hepatic expression of mSult2a1 in the mOat2 knockout and of mHsd17b6 and mLcn2 in the hOAT7 knockin mice. In humans, all three genes are involved in the development of hepatocellular carcinoma. Furthermore, we established a method for the easy isolation and culture of primary mouse hepatocytes from both mouse lines via ex vivo liver perfusion. Thereby we created a powerful tool for characterization of OAT2 and OAT7. Taken together, with the help of stably transfected cell lines we performed an in-depth investigation of the transport function of hOAT2 and mOat2. We were able to identify novel substrates for both hOAT2 and mOat2 and showed that hOAT2 is likely to have an important role in cGMP signaling. Two newly generated mouse models were established and extensively characterized whereby their applicability for the functional characterization of OAT2 and OAT7 could be confirmed. In future experiments, the generated stably transfected cell lines and mouse models can complement each other in the elucidation of the physiological and pharmacological roles of OAT2 and OAT7 as well as in the search for novel drug substrates of both transporters.

Dissertation ist gesperrt bis 07.08.2025 !

Membrantransporter vermitteln den Transport einer Vielzahl endogener sowie exogener Substanzen über die Zellmembran und sind daher nicht nur essentiell für die Homöostase, sondern auch für die Aufnahme, Verteilung, Metabolisierung und Exkretion von Medikamenten. Aus diesem Grund ist die funktionelle Charakterisierung von Membrantransportern entscheidend, sowohl um ihre physiologische Funktion zu verstehen als auch um schwere Nebenwirkungen von verabreichten Medikamenten oder ein Therapieversagen zu vermeiden. Die organischen Anionentransporter 2 und 7 (OAT2, SLC22A7 und OAT7, SLC22A9) ermöglichen den Transport von organischen Anionen über die Zellmembran und sind bisher nur unzureichend charakterisiert. Beide Transportproteine sind in der sinusoidalen Membran der Hepatozyten exprimiert, OAT2 kann außerdem in den proximalen Tubuluszellen der Niere gefunden werden. Für OAT7 wurden bisher nur wenige Substrate identifiziert und obwohl bereits einige endogene und exogene Substrate für OAT2 bekannt sind, bleibt die physiologische sowie die pharmakologische Rolle der beiden Transportproteine ungeklärt. Das Ziel dieser Arbeit war es daher eine funktionelle Charakterisierung von OAT2 und OAT7 mithilfe von Transporter-exprimierenden Zelllinien sowie mit zwei neuen transgenen Mausmodellen vorzunehmen. Stabil transfizierte Zelllinien, welche hOAT2 des Menschen und sein Maus Ortholog mOat2 sowie hOAT7 und andere relevante hepatische sinusoidale Aufnahmetransporter exprimieren, wurden genutzt, um die Transportfunktion von OAT2 und OAT7 mittels in vitro Experimenten zu untersuchen. Der Transport des sekundären Botenstoffes cGMP durch hOAT2 wurde schon zuvor beschrieben und konnte in dieser Arbeit bestätigt werden. Wir konnten außerdem zeigen, dass auch mOat2 in der Lage ist, cGMP zu transportieren. Die cGMP Transportfunktion für hOAT2 und mOat2 wurde eingehend charakterisiert, wobei insbesondere auf speziesspezifische Unterschiede geachtet wurde. Wir konnten zusätzlich zeigen, dass hOAT2 als einziger der für den Arzneistofftransport hauptverantwortlichen hepatischen sinusoidalen Aufnahmetransporter in der Lage ist cGMP zu transportieren. Dies impliziert eine wichtige Rolle von hOAT2 im cGMP Signalweg und damit in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen. Der OAT2-vermittelte Transport von Xanthin, einem Zwischenprodukt des Purin Abbaus, wurde ebenfalls schon zuvor beschrieben, wobei wir in dieser Arbeit zum ersten Mal nachweisen konnten, dass dieser Transport zeit- und konzentrationsabhängig stattfindet. Außerdem konnten wir zeigen, dass hOAT2, ähnlich wie für cGMP, der einzige der für den Arzneistofftransport hauptverantwortlichen hepatischen sinusoidalen Aufnahmetransporter ist, der in der Lage ist Xanthin zu transportieren. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Xanthin kein Substrat von mOat2 ist. Wir konnten außerdem eine neue Substratklasse für OAT2 identifizieren. Verschiedene Pterine, welche wichtige Funktionen in verschiedenen physiologischen Prozessen, beispielsweise als Kofaktoren von Enzymen, haben, wurden als Substrate von hOAT2 und mOat2 identifiziert. Wie auch schon bei cGMP und Xanthin, fanden wir speziesspezifische Unterschiede in Substratspezifität und Transportfunktion zwischen humanem und Maus OAT2. Der hOAT2-vermittelte Transport von Neopterin, welches eine bedeutende Rolle im Immunsystem einnimmt, wurde umfassend charakterisiert. Um der physiologischen Rolle von OAT2 und OAT7 auf den Grund zu gehen, haben wir einerseits ein mOat2-Knockout und andererseits ein hepatozytenspezifisches hOAT7-Knockin Mausmodell entwickelt und die Anwendbarkeit dieser Tiere für die Erforschung der beiden Membrantransporter getestet. Die mOat2-Knockout Mäuse waren genau wie die hOAT7-Knockin Mäuse gesund und zeigten keine phänotypischen Auffälligkeiten. Histologische Untersuchungen der Leber und klinisch-chemische Parameter waren vergleichbar mit denen von Kontrollmäusen. Durch umfassende Charakterisierung auf DNA, RNA und Proteinebene mittels einer Vielzahl von molekularbiologischen Methoden wie qPCR, Immunblot Analysen und immunhistochemischen Färbungen, konnten wir zeigen, dass die Mäuse der beiden Linien wie erwartet die fehlende Expression von mOat2 bzw. die leberspezifische Expression von hOAT7 zeigen. Genomweite Genexpressionsanalysen zeigten veränderte hepatische Expressionswerte von mSult2a1 in den mOat2-Knockout und von mHsd17b6 und mLcn2 in den hOAT7-Knockin Mäusen. Alle drei Gene sind im Menschen an der Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms beteiligt. Überdies haben wir eine neue Methode zur einfachen ex vivo Isolation und Kultur primärer Maus Hepatozyten beider Mauslinien etabliert und damit ein leistungsstarkes Werkzeug für die Charakterisierung von OAT2 und OAT7 geschaffen. Zusammengefasst konnten wir mithilfe stabil transfizierter Zelllinien eine eingehende Analyse der Transportfunktion von hOAT2 und mOat2 durchführen. So konnten neue Substrate für hOAT2 und mOat2 identifiziert und gezeigt werden, dass hOAT2 vermutlich eine wichtige Rolle im cGMP Signalweg spielt. Zwei neu generierte Mausmodelle wurden etabliert und umfassend charakterisiert, womit ihre Eignung für die funktionelle Charakterisierung von OAT2 und OAT7 bestätigt werden konnte. In zukünftigen Experimenten können die in dieser Arbeit generierten stabil transfizierten Zelllinien und die Mausmodelle gemeinsam dazu dienen, die physiologische und pharmakologische Rolle von OAT2 und OAT7 aufzuklären sowie neue Arzneistoffe als Substrate der Transportproteine zu identifizieren.