Evaluierung und Optimierung einer rheometrischen Messmethode mittels piezoelektrischer Sonde zur Hämostaseüberwachung

Abstract

Die extrakorporale Zirkulation (EKZ) kann die Funktion des Herzens und der Lungen vorübergehend ersetzen. Hierbei wird Blut aus den venösen Gefäßen entnommen und über einen Oxygenator decarboxyliert und oxygeniert. Anschließend wird das Blut wieder in den Blutkreislauf des Patienten zurückgeführt. Die Herz-Lungen-Maschine (HLM) und die extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO) werden der EKZ zugeordnet. Bei einer HLM ist ein kompletter Bypass des Lungen- und Herzkreislaufs möglich. Über eine Kanüle wird Blut in der oberen und unteren Hohlvene oder im rechten Vorhof passiv oder aktiv in ein venöses Reservoir geleitet. Im venösen Reservoir kann Blut zurückgehalten werden, damit das Blutvolumen genau gesteuert werden kann. Von dort wird das Blut ebenfalls durch eine Rollerpumpe über einen Oxygenator und einen Wärmetauscher gepumpt bevor es über einen Blasenfilter in den arteriellen Kreislauf (z. B. die Aorta) des Patienten zurückgelangt. Bei einem funktionellen Herz oder einem stillstehenden Herz kann die HLM einen Gasaustausch und einen temperierten systemischen Blutfluss mit definiertem Perfusionsdruck ermöglichen. Eine Weiterentwicklung der HLM ist die ECMO. Sie ermöglicht die temporäre Unterstützung von Intensivpatienten mit Lungenversagen, Herz-Kreislauf-Versagen oder kombiniertem Herz-Lungen-Versagen. Hierbei werden große Gefäße des Körpers kanüliert und anhand der Indikation werden die Patienten mittels verschiedener venöser und arterieller Anschlussmöglichkeiten behandelt (weitere Details siehe Einleitung). Anschließend passiert das Blut eine Zentrifugalpumpe und einen Oxygenator und kehrt oxygeniert zum Patienten zurück. Beim Durchlaufen des Blutes durch die Pumpe, den Oxygenator und den Dialysator entstehen Scherkräfte. Des Weiteren fließt das Blut durch Schläuche, die eine große Fremdoberfläche darstellen. Hierbei können die Fremdoberflächen der Membrane und Schläuche bei der EKZ sowie die auftretenden Scherkräfte in den Pumpen und dem Oxygenator eine Aktivierung der Hämostase induzieren, was zu einer lebensbedrohlichen Gerinnungsaktivierung führen kann. Des Weiteren kann es während der EKZ zu Komplikationen wie dem akuten Atemnotsyndrom (ARDS), dem systemischen inflammatorischen Response-Syndrom (SIRS) oder dem Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS) kommen. Der Grund für diese Aktivierung ist das Zusammenwirken verschiedener Blutaktivierungswege wie der mechanischen und chemischen Zellaktivierung, der Dysfunktion der Immunregulation und der Aktivierung der Gerinnungskaskade. Deshalb ist eine kontinuierliche Überwachung der Hämostase von besonderer Bedeutung, da sonst Blutungskomplikationen oder Thromboembolien auftreten können. Die moderne Intensivmedizin bietet derzeit keine kleine, einfache, bedienbare und leicht interpretierbare Point-of-Care- Lösung zur Überwachung des Gerinnungsstatus oder der Blutgerinnungsproblematik an. Eine zuverlässige Abbildung der gesamten Hämostase (Gerinnung, Fibrinolyse, Thrombozytenfunktion) mit einem einzigen Messgerät ist nur durch die viskoelastischen Methoden wie den ROTEM und die Thromboelastographie (TEG) gegeben. Allerdings sind beide Geräte teuer, groß, erschütterungsempfindlich und können nicht neben dem Patienten bedient werden. Außerdem können die Ergebnisse nur von einem Experten interpretiert werden. Die Verwendung eines kleinen, einfachen Point-of-Care-Geräts mit minimalem Schulungsaufwand für die behandelnden Ärzte ist wünschenswert. Das Fachgebiet der Rheologie bietet Lösungen für solch umfassend technische Problematiken an. Rheologische Messungen können wertvolle Informationen über die viskoelastischen Eigenschaften komplexer Flüssigkeiten, z. B. von Blut liefern. Die Überwachung der Änderungen der viskoelastischen Eigenschaften des Blutes bei einsetzender Blutgerinnung liefert einen Echtzeit-Indikator für den Blutgerinnungsstatus eines Patienten. Ein essenzielles Protein des Gerinnungsprozesses ist das Enzym Thrombin, das Fibrinogen in unlösliches Fibrin umwandelt. Parallel in der Endphase an die Gerinnungskaskade wird Fibrin mit aggregierten Plättchen vernetzt, was zu einem Fibrin-Thrombozyten-Netz führt. Das Ergebnis ist eine Zunahme des viskosen und elastischen Anteils der Viskosität im Blut. Im Rahmen dieser Arbeit wurde im ersten Schritt die Leistung eines piezobasierten Messsystems (piezoelektrischen Axialvibrators, PAV) mit einem kommerziell erhältlichen rheologischen Oszillationsrheometer (Kinexus Pro, Malvern) verglichen. Da der PAV nur für technische Flüssigkeiten wie Polymerlösungen verwendet wurde, erfolgte die Kalibrierung des Geräts mit technischen Ölen. Anschließend wurden die Zuverlässigkeit, die Reproduzierbarkeit der Messungen und die Einschränkungen des Piezosystems untersucht. Außerdem wurden Vergleichsmessungen zwischen PAV und Kinexus Pro mit verschiedenen Xanthan-Konzentrationen (0,1 5 %) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten durch überlappende Messbereiche der Geräte, dass das Piezosystem reproduzierbar messen kann und vergleichbare Ergebnisse wie das Kinexus Pro liefert. Somit können die Erkenntnisse der Rheologie von technischen Flüssigkeiten auf Blut übertragen werden. Zur Bestätigung der Nutzbarkeit der rheologischen Messgeräte wurden verschiedene Parameter der Hämostase näher untersucht. Die Gerinnungszeit (Clotting time, CT) als ein Parameter zur Überwachung des Gerinnungsstatus konnte durch das Messen der viskoelastischen Eigenschaften detektiert werden. Während des Gerinnungsprozesses nimmt die Scherviskosität mit der Zeit zu, wobei der lineare Anstieg die Dynamik der Gerinnselbildung beschreibt. Die Gerinnselfestigkeit entspricht der Festigkeit des gebildeten Blutgerinnsels, die von der Fibrinvernetzung und der Thrombozytenzahl abhängt und messtechnisch durch die maximale Viskosität erfasst werden konnte. Im nächsten Schritt wurde ein Oszillationsrheometer für eine detailliertere Evaluierung der Hämostase mit verschiedenen Gerinnungsaktivatoren und -inhibitoren herangezogen. Als Referenzsystem diente ein medizinisches Kugelkoagulometer (KC 1A, ABW Medizin Technik GmbH). Die vorliegenden Daten zeigten, dass das Oszillationsrheometer in der Lage ist, den Hämostasestatus mit verschiedenen Aktivatoren und verschiedenen Inhibitorkonzentrationen dynamisch zu messen. Da das Oszillationsrheometer für den klinischen Alltag zu groß und zu teuer ist und erschütterungsempfindlich ist, wurde im letzten Schritt dieser Arbeit ein optimiertes Piezosystem (PIEZ) konstruiert und gebaut. Das neue PIEZ war zudem sensitiver für Blutmessungen als das bislang genutzte PAV-System. Zusätzlich zu etablierten Gerinnungsaktivatoren und -inhibitoren wurde die Wirkung des gerinnungshemmenden Thrombin-Aptamers NU172 als mögliches Antikoagulanz sowohl unter statischen als auch unter dynamischen Fließbedingungen getestet. Aptamere sind einzelsträngige Oligonukleotide mit dreidimensionalen Strukturen, die mit hoher Affinität und Spezifität an ein Zielmolekül binden können. Die Wirkung des Aptamers kann durch die komplementäre Sequenz (Antidote, AD) aufgehoben werden. In der klinischen Praxis könnten Thrombin-Aptamere wie NU172 während der EKZ in Kombination mit einer reduzierten Heparinkonzentration oder für Patienten mit einer heparininduzierten Thrombozytopenie (HIT) verwendet werden. Das Thrombin-Aptamer wurde vergleichend mit Heparin auf die antikoagulatorische Wirkung mit dem PIEZ getestet. Hierbei zeigten sich eine Verlängerung der CT, eine selektive Hemmung der Thrombin-vermittelten Thrombozytenaktivierung (Abnahme des Thrombozytenaktivierungsmarkers, β-Thromboglobulin, β-TG) und Reduktionen der Ex-vivo-Thrombose, die durch eine Abnahme der fibrinreichen Thrombusbildung (Abnahme der maximalen Viskosität) erreicht wird. Zudem wurde die Aufhebung der Aptamerwirkung durch die komplementäre Antidotsequenz (AD) mit dem PIEZ bestätigt. Mit dem PIEZ ist zum ersten Mal eine kontinuierliche Erfassung der Wirkung des Aptamers auf die Gerinnung möglich. Das optimierte PIEZ und die Untersuchungen in dieser Arbeit dienen als Basis zur Weiterentwicklung hin zu einem Point-of-Care-Gerät. Jedoch sind weitere Optimierungen (Fluidiksystem, automatisierte Pipettierung und Reinigung) und Studien notwendig, um das Ziel eines Point-of-Care-Hämostase-Systems zu erreichen.

Extracorporeal circulation (ECC) can temporarily replace the function of the heart and the lungs. In this process, blood is taken from the venous vessels and is decarboxylated and oxygenated via an oxygenator. The blood is then returned to the patient's cardiovascular system. The heart-lung machine (HLM) and extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) belong to the ECC. With a heart-lung machine (HLM), a complete bypass of the pulmonary and cardiovascular system is possible. Through a cannula, blood in the superior and inferior vena cava or in the right atrium is passively or actively directed into a venous reservoir. Blood can be retained in the venous reservoir so that blood volume can be precisely controlled. From there, the blood is also pumped by a roller pump through an oxygenator and heat exchanger before returning through a bubble filter to the patient's arterial circulation (e.g. the aorta). In the presence of a functional heart or an arrested heart, HLM can provide gas exchange and tempered systemic blood flow with defined perfusion pressure. A further development of the HLM is the ECMO. It enables temporary support of intensive care patients with lung failure, cardiovascular failure or combined heart-lung failure. In this procedure, large vessels of the body are cannulated and based on the indication, patients are treated using various venous and arterial connection options (see Introduction for more details). The blood passes through a centrifugal pump and an oxygenator and then the oxygenated blood returns to the patient. Shear forces are generated as the blood passes through the pump, oxygenator and dialyser. Additionally, the blood flows through the tubes which represent a large foreign surface. Furthermore, complications such as acute respiratory distress syndrome (ARDS), systemic inflammatory response syndrome (SIRS), or multiple organ dysfunction syndrome (MODS) may occur during ECC. The reason for this activation is the interaction of different blood activation pathways such as mechanical and chemical cell activation, dysfunction of immune regulation, and activation of the coagulation cascade. Here, the foreign surfaces of the membrane and tubing during ECC and the shear forces that occur in the tubing and pumps can induce activation of haemostasis, which can lead to life-threatening clot activation. Therefore, continuous monitoring of haemostasis is of particular importance, otherwise bleeding complications or thromboembolism may occur. Currently, the modern intensive care does not provide a comprehensive point-of care solution for monitoring coagulation status or coagulation problems. Reliable monitoring of overall haemostasis (coagulation, fibrinolysis, platelet function) with a single measurement device is only provided by viscoelastic methods such as ROTEM and thromboelastography (TEG). However, both devices are too expensive, too large, sensitive to vibration, and cannot be operated next to the patient. In addition, the results can only be interpreted by an expert. The use of a small, simple point-of-care device with minimal training requirements for treating physicians is desirable. Such a system is desirable due to the limited space in the operating room and intensive care unit. Therefore, a measurement method is needed that on the one hand covers the different aspects of haemostasis and on the other hand that can be performed without sample preparation by using a patient-side single measurement device with minimal effort of training for the analyst. We intend to address the point-of-care issue by rheometry, which can provide important information about the microstructure and dynamics of complex fluids such as polymer solutions and suspensions of colloid particles. Similar to those technical solutions, human whole blood is a complex suspension of various cell types and proteins that is subject to continuous variations. Monitoring the changes in viscoelastic properties of blood clotting provides a real-time indicator of the blood coagulation status of a patient. The conversion of fibrinogen into insoluble fibrin through the enzyme thrombin is an important part of the coagulation process. Following the coagulation cascade, fibrin is cross-linked with aggregated platelets leading to a platelet-fibrin mesh. This increases the viscoelastic shear viscosity of coagulated blood.

The first step in this work was to compare the performance of a piezo based research measuring system (piezoelectric axial vibrator, PAV) with a commercially available rheological oscillation rheometer (Kinexus Pro, Malvern). Usually, the piezo system is used for technical fluids, e.g. polymer solutions. For this reason, the device was initially calibrated with technical oils, which investigated the reproducibility of the measurements and the limitations of the piezo system. In addition, comparative measurements were performed between PAV and Kinexus Pro with various xanthan concentrations (0.1 - 5%). The data showed that the piezo system measures reliably and provides comparable results with the Kinexus Pro due to overlapping measuring ranges for different xanthan concentrations. Thus, the findings of the rheology of technical fluids can be transferred to blood. The clotting time (CT) can be obtained by measuring changes of viscoelastic properties of human whole blood, which is an important indicator of the patient’s coagulation status. During the coagulation process the viscous and elastic components increase over time and the linear slope describes the dynamics of clot formation. The maximum shear viscosity provides information on clot firmness, which is dependent on blood fibrinogen level, fibrin cross-linking and platelet numbers. In the next step, the oscillation rheometer was used for a more detailed evaluation with different coagulation activators and inhibitors using a ball coagulometer (KC 1A, ABW Medizin Technik GmbH) as reference system. The obtained data showed that the oscillation rheometer is able to measure the haemostasis status dynamically with different activators and different inhibitor concentrations. As the oscillation rheometer is too large and too expensive for the clinical routine and also too sensitive to vibrations, in the last step of this work an optimised piezo-method (PIEZ) was planned and constructed based on the PAV. The new PIEZ is also more sensitive to blood measurements than the PAV system. In addition, to the establised activators and inhibitors of coagulation, the anti- thrombin aptamer NU172 was tested as a potential anticoagulant under static and dynamic flow conditions. Aptamers are single-stranded oligonucleotides that can fold into three-dimensional structures and bind to targeting molecules with high affinity and specificity. The effect of the aptamer can be reversed by the complementary sequence (antidote, AD). In clinical practice, thrombin aptamers such as NU172 could be used during extracorporeal circulation in combination with a reduced heparin concentration or as a substitution for patients with heparin-induced thrombocytopenia (HIT). The PIEZ was able to detect the inhibitory effect of the aptamer and the abrogation of the inhibition by the antidote sequence. The aptamer prolongs the blood coagulation and the thrombin-mediated platelet activation is selectively inhibited (decrease of platelet activating marker, β-thromboglobulin, β-TG). Additionally reductions in ex vivo thrombosis driven by a decrease in fibrin-rich thrombus formation (decrease in maximum shear viscosity) can be observed. For the first time a continuous detection of the effect of the aptamer on coagulation is possible with the PIEZ. The optimised PIEZ and the investigations in this work serve as basis for developments towards a point-of-care device. Further improvements (fluidic system, automated pipetting and cleaning) and studies are needed to reach the ultimative goal, the development of a point-of-care haemostasis system.