cGMP Imaging Uncovers New Roles and Therapeutic Implications of NO/cGMP Signaling in the Kidney and in Melanoma

Abstract

Generation of cyclic guanosine monophosphate (cGMP) via nitric oxide (NO)-sensitive guanylyl cyclase (NO GC) has been implicated in the regulation of many physiological processes. Therefore, it is not surprising that pharmacological modulation of the NO/NO GC/cGMP pathway has been proposed for treatment of several diseases like heart failure and hypertension. The pathophysiological conditions in some of these diseases involve increased oxidative stress and decreased NO bioavailability. Pharmacological NO GC stimulators counteract decreased NO bioavailability, as they can stimulate NO GC synergistically with NO. Oxidative stress, however, might lead to oxidation of NO GC’s heme cofactor, making it unresponsive to NO. NO GC activators specifically activate this heme-oxidized NO GC. The present study aimed to identify the role of the NO GC/cGMP signaling pathway in the kidney and in melanoma, and to explore how NO GC could be utilized as drug target in these tissues. To address these questions, cGMP was visualized in real time in live cells and tissues using a Förster/fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based cGMP biosensor. For the first time, the spatiotemporal dynamics of cGMP signals induced by NO, the NO GC stimulators riociguat and BAY 41 2272, as well as the NO GC activator BAY 543 were analyzed in the kidney and in melanoma. Thereby, it was determined in which anatomical structures and under which conditions these drugs exert their effects. The cGMP imaging results were validated with classical immunostaining of tissue sections and Western Blot. Furthermore, the pathophysiological relevance of the NO GC/cGMP signaling pathway in melanoma was investigated by analyzing the in vivo tumor growth in tissue-specific NO GC knock-out mice. NO increased the glomerular cGMP levels in kidney slices ex vivo. NO GC stimulator potentiated this NO-induced cGMP generation. After ODQ-mediated NO GC oxidation, however, NO as well as NO GC stimulator were no longer able to induce cGMP generation, whilst NO GC activator strongly increased glomerular cGMP levels. In collaboration with specialized labs, these renal effects of NO GC activator were shown to correlate with dilation of glomerular arterioles and improved blood flow in the kidney. In primary melanoma, NO-induced cGMP generation was selectively detected in perivascular cells of the tumor stroma, most likely pericytes. NO GC stimulator potentiated the NO-induced cGMP generation in these tumor pericytes, similar to its effect in the murine kidney. Remarkably, Cre/loxP-mediated NO GC knock-out in the tumor pericytes resulted in reduced tumor growth in male mice, probably via an impaired tumor perfusion. Taken together, in the murine kidney and in melanoma, NO GC was found to be involved in (patho )physiologically relevant processes. In both tissues, NO GC stimulators potently increased the NO-induced cGMP generation in the vasculature. NO GC activators were ineffective under basal conditions but induced robust cGMP generation in renal glomeruli in the presence of ODQ. These results supported the hypothesis that the growing line-up of NO GC modulators can be utilized for the treatment of diseases involving dysregulated NO/NO GC/cGMP signaling.

Die Biosynthese von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) durch die NO sensitive Guanylylzyklase (NO GC) ist in die Regulation vieler physiologischer Prozesse involviert. Daher ist es nicht weiter verwunderlich, dass sich die pharmakologische Modulation des NO/NO GC/cGMP-Signalwegs als Möglichkeit etabliert hat, verschiedene Krankheiten wie Herzinsuffizienz und Bluthochdruck zu behandeln. In einigen dieser Krankheiten zählen oxidativer Stress und eine verringerte NO-Bioverfügbarkeit zu den pathophysiologischen Merkmalen. Sogenannte NO GC-Stimulatoren stimulieren die NO GC synergistisch mit NO, wodurch die cGMP-Bildung trotz verringerter NO-Bioverfügbarkeit aufrechterhalten werden kann. Oxidativer Stress kann jedoch zur Oxidation des Häm-Kofaktors der NO GC führen, was im Folgenden eine Stimulation durch NO verhindert. Die sogenannten NO GC-Aktivatoren aktivieren spezifisch diese Häm-oxidierte NO GC. Das Ziel dieser Studie war, die Funktion des NO GC/cGMP-Signalwegs in der Niere und im Melanom zu untersuchen und herauszufinden, wie NO GC in diesen Geweben als Angriffspunkt für Therapien genutzt werden könnte. Dazu wurde cGMP in lebenden Zellen und Gewebeschnitten mithilfe eines Förster /Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET)-basierten cGMP-Biosensors in Echtzeit sichtbar gemacht. Zum ersten Mal konnten cGMP-Signale hervorgerufen durch NO, die NO GC-Stimulatoren Riociguat und BAY 41 2272, sowie den NO GC-Aktivator BAY 543 in der Niere und im Melanom mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung untersucht werden. In diesem Zusammenhang wurde bestimmt, in welchen anatomischen Strukturen und unter welchen Bedingungen diese Substanzen wirksam sind. Die Ergebnisse dieser hochmodernen cGMP-Bildgebung wurden mit klassischen immunhistologischen Färbungen sowie Western Blots validiert. Weiterhin wurde das Tumorwachstum in gewebespezifischen NO GC-Knockout-Mäusen verfolgt, um die pathophysiologische Relevanz des NO GC/cGMP-Signalwegs im Melanom zu untersuchen. NO führte zur Erhöhung der cGMP-Konzentration in den Glomeruli von Nierenschnitten ex vivo. Der NO GC-Stimulator verstärkte diese NO-induzierte cGMP-Biosynthese. Nach Oxidation der NO GC durch den Inhibitor ODQ konnten NO und der NO GC-Stimulator keine cGMP-Bildung mehr hervorrufen, während der NO GC-Aktivator die glomeruläre cGMP-Konzentration stark erhöhte. In Zusammenarbeit mit spezialisierten Laboren konnte gezeigt werden, dass diese Effekte von NO GC-Aktivatoren in der Niere mit der Dilatation von glomerulären Arteriolen sowie einer Verbesserung des Blutflusses in der Niere einhergehen. Im Melanom wurde NO-induzierte cGMP-Bildung ausschließlich in perivaskulären Zellen – vermutlich Perizyten – des Tumorstromas beobachtet. Der NO GC-Stimulator verstärkte diese NO-induzierte cGMP-Biosynthese in den Perizyten der Tumorgefäße, ganz ähnlich zu seiner Wirkung in der Niere. Bemerkenswerterweise war in männlichen Mäusen mit Cre/loxP-vermitteltem NO GC-Knockout in den Perizyten der Tumorgefäße das Tumorwachstum stark verringert, vermutlich bedingt durch eine schlechtere Durchblutung der Tumoren. Insgesamt wurde gezeigt, dass die NO GC in der Niere und im Melanom ein wichtiger Regulator von (patho-)physiologisch relevanten Prozessen ist. In beiden Geweben verstärkten NO GC-Stimulatoren die NO-induzierte cGMP-Biosynthese. NO GC-Aktivatoren hingegen hatten keine Effekte unter basalen Bedingungen, riefen aber in der Gegenwart von ODQ cGMP-Bildung in den renalen Glomeruli hervor. Diese Ergebnisse stützten die gegenwärtige Hypothese, dass die Wirkstoffklasse der NO GC-Modulatoren für die Behandlung von Krankheiten mit fehlreguliertem NO/NO GC/cGMP-Signalweg geeignet ist.