Biomarker qualification for drug-induced liver injury across species using immunoaffinity mass spectrometry

Abstract

Drug-induced liver injury remains one of the major complications during patient treat- ment and accounts for more than 10% of all cases of acute liver failure. Accordingly, drug withdrawals from the global market still occur frequently. Standard diagnosis and prediction of DILI involves assessment of alanine aminotransferase (ALT) combined with careful evaluation and exclusion of other underlying liver impairments as current gold standard. However, the predictive value of this assessment method is rarely DILI- specific. Current efforts in investigating clinical DILI studies revealed potential new DILI protein biomarkers including glutamate dehydrogenase (GLDH), high-mobility group protein B1 (HMGB1), full-length and caspase-cleaved keratin 18 (K18, ccK18), macrophage colony stimulating factor 1 receptor (MCSF1R), and osteopontin (OPN). As potential mechanistic markers for immune response and hepatocyte apoptotis and necrosis upon drug treatment, these proteins may increase the specificity of DILI diag- nosis and potentially have higher predictive value for DILI diagnosis. The use of these proteins as potential DILI biomarkers in animal studies, thus, their translatability from human to animal for preclinical studies, is of particular interest to intervene earlier in drug development with improved DILI diagnosis. Furthermore, serum and plasma are both used as clinically relevant samples but their comparability regarding preanalytical matrix and sampling effects is not completely examined for the proteins under investi- gation. Immunoaffinity liquid chromatography tandem mass spectrometry (IA-LC-MS/MS) was used to develop multiplexed assays for quantification of the potential DILI biomark- ers. The multiplexed assays were used to elucidate matrix and sampling effects in human plasma and serum samples. Sandwich immunoassays were compared with IA- LC-MS/MS read-out. Furthermore, the effect of drugs and compounds, which are known to induce hepatic injury, was examined in preclinical studies in rat models to test for biomarker translatability. Acetaminophen (APAP), 4,4’-methylene dianiline (DAPM), thioacetamide, bromobenzene, and carbon tetrachloride (CCl4) were used for this purpose. APAP, thioacetamide, and bromobenzene were tested for dose effects, while time-dependent effects were monitored for DAPM and CCl4 and daily drug treat- ment was tested for CCl4. HMGB1 and MCSF1R were affected the most by matrix effects in serum and plasma. Serum HMGB1 levels were significantly higher than plasma levels by up to 12-fold, whereas MCSF1R content was higher in plasma than in serum by about 20%. Analyte release within the first 60 min between sample collection and centrifugation was ob- served for HMGB1 in serum with up to 200% increase during the sampling procedure. Other analytes showed either no significant change over time or remained within 10% of the base level. IA-LC-MS/MS provided a powerful tool to investigate the protein sequence of MCSF1R in rat plasma revealing more experimental evidence for the unre- viewed protein sequence with Uniprot ID D4ACA7 compared to the reviewed protein sequence with Uniprot ID Q00495. However, chromatographic and stability-related challenges were observed with the initially targeted K18 and ccK18 peptides for mea- surement. Therefore, ELISA kits were used for read out of matrix and sampling effects for K18 and ccK18. The IA-LC-MS/MS approach was better applicable to quantify OPN in serum and plasma due to better correlation compared to the sandwich im- munoassay approach. K18 and one of the investigated HMGB1 peptides were found to be susceptible to tryptic side-reactivity, likely produced by autolytic production of pseudotrypsin with chymotryptic-like activity. Addition of PMSF before proteolysis was found to rescue the according K18 and HMGB1 peptides. Analysis of preclin- ical studies with the presented drugs and compounds confirmed GLDH as potential marker for acute hepatic cell death. Furthermore, OPN levels were shown in con- cordance with GLDH levels except for CCl4 treatment, where GLDH levels further increased with longer treatment time, while OPN remained at the same level. Since elevated OPN concentration upon drug treatment was observed in this animal model, OPN may serve as translational immune response marker for DILI. HMGB1 might be rather a biomarker for liver fibrosis than for acute liver failure since APAP and DAPM treatment showed steady HMGB1 levels, whereas thioacetamide and CCl4 as known fibrosis-inducing agents resulted in elevated HMGB1 levels. Corresponding to previous RNA expression results, GLDH was observed predominantly in liver followed by kidney and brain tissue. In summary, this work contributes to better understanding for the use of trypsin in IA-LC-MS/MS assays and for matrix and sampling effects on the potential DILI biomarkers. Most importantly, translational value of GLDH and OPN as potential DILI biomarker in rats as animal model is supported by the observed results, while HMGB1 as marker for acute liver injury is further under question.

Medikamenteninduzierte Leberschädigung (drug-induced liver injury, DILI) ist nach wie vor eine der größten Nebenwirkungen bei der Behandlung von Patienten und macht mehr als 10% aller Fälle von akutem Leberversagen aus. Dementsprechend kommt es immer noch häufig zu Rücknahmen von Arzneimitteln vom Weltmarkt. Der Goldstan- dard zur Diagnose und Vorhersage von DILI umfasst insbesondere die Bestimmung der Alaninaminotransferase (ALT) in Verbindung mit einer sorgfältigen Bewertung und dem Ausschluss anderer zugrundeliegender Leberschäden. Die Vorhersage für DILI nach dieser Mess- und Bewertungsmethode ist jedoch selten spezifisch. Aktuelle Unter- suchungen klinischer DILI-Studien ergaben potenzielle neue Proteinbiomarker für DILI, darunter glutamate dehydrogenase (GLDH), high-mobility group protein B1 (HMGB1), keratin 18 (K18 in voller Länge und ccK18 als durch Kaspase gespaltenes Produkt), macrophage colony stimulating factor 1 receptor (MCSF1R), and osteopontin (OPN). Diese Proteine könnten möglicherweise durch ihre Funktion als potenzielle mechanis- tische Marker sowohl für die Immunreaktion, als auch für Apoptose und Nekrose von Hepatozyten bei medikamentöser Behandlung eine bessere Diagnose und Vorhersage spezifisch für DILI liefern. Die Verwendung dieser Proteine als potenzielle Biomarker für DILI in Tierversuchen und damit ihre Übertragbarkeit vom Menschen auf das Tier für präklinische Studien ist von besonderem Interesse, um mit einer verbesserten Di- agnose von DILI in Fällen von Leberschädigung früher in der Arzneimittelentwicklung einzugreifen. Sowohl Serum als auch Plasma werden als klinische Probenmatrix ver- wendet, aber ihre Vergleichbarkeit hinsichtlich präanalytischer Matrix- und Proben- bearbeitungseffekten ist nicht vollständig untersucht. Basierend auf der Methode immunoaffinity liquid chromatography tandem mass spec- trometry (IA-LC-MS/MS) wurden Assays zur multiplexen Quantifizierung der poten- ziellen Biomarker für DILI entwickelt. Diese Assays wurden zur Aufklärung von Matrix- und Probenbearbeitungseffekten in humanen Plasma- und Serumproben verwendet. Herkömmliche Sandwich-Immunassays wurden mit den Ergebnissen der IA-LC-MS/MS- Methode verglichen. Um die Übertragbarkeit von Biomarkern zu testen, wurde die Wirkung von Arzneimitteln und Reagenzien, von denen bekannt ist, dass sie Leber- schäden hervorrufen, in präklinischen Studien mit Ratten als Tiermodell untersucht. Acetaminophen (APAP), 4,4’-Methylendianilin (DAPM), Thioacetamid, Brom-benzol und Tetrachlorkohlenstoff (CCl4) wurden hierfür verwendet. APAP, Thioacetamid und Brombenzol wurden auf Dosiseffekte hin getestet, während für DAPM und CCl4 zeitab- hängige Effekte und für CCl4 eine tägliche Medikamentenbehandlung untersucht wur- den. HMGB1 und MCSF1R waren am stärksten von Matrixeffekten in Serum und Plasma betroffen. Die Konzentrationen von HMGB1 im Serum waren signifikant höher als in Plasma, und zwar um das bis zu 12-fache, während die Konzentration von MCSF1R in Plasma um etwa 20% höher war als in Serum. Ein Anstieg von bis zu 200% wurde für HMGB1 in Serum innerhalb der ersten 60 min zwischen Probenentnahme und Zentrifugation beobachtet, während andere Biomarkerkonzentrationen entweder keine signifikante Veränderung über diese Zeitspanne hinweg zeigten oder innerhalb von 10% Varianz blieben. IA-LC-MS/MS stellt eine leistungsfähige Methode zur Unter- suchung der Proteinsequenz von MCSF1R in Rattenplasma dar, mithilfe derer ex- perimentelle Beweise für die Proteinsequenz mit der Uniprot-ID D4ACA7 gesammelt wurden, die als nicht geprüft gilt, als im Vergleich zur Proteinsequenz mit der Uniprot- ID Q00495. Bei den ursprünglich zur Untersuchung herangezogenen Peptiden K18 und ccK18 gab es allerdings chromatografische und stabilitätsbedingte Herausforderun- gen zur Messung, weshalb ELISA-Kits zum Auslesen von Matrix- und Probenbear- beitungseffekten für K18 und ccK18 verwendet wurden. Der IA-LC-MS/MS-Ansatz war für die Quantifizierung von OPN aufgrund der Serum- /Plasmakorrelation der Ergebnisse besser geeignet als der Sandwich-Immunassay-Ansatz. K18 und eines der untersuchten HMGB1-Peptide erwiesen sich als anfällig für eine tryptische Nebenreak- tion, die wahrscheinlich durch die autolytische Produktion von Pseudotrypsin, welches eine chymotryptischer Aktivität aufweist, hervorgerufen wird. Die Zugabe von PMSF vor der Proteolyse konnte die entsprechenden Peptide für K18 und HMGB1 wieder- herstellen und im Falle von K18 sogar messbar machen. Die Analyse der präklinis- chen Studien mit den untersuchten Arzneimitteln und Reagenzien bestätigte GLDH als potenziellen Marker für den akuten Leberzelltod. Außerdem zeigte sich, dass die Konzentration von OPN sich analog zur Konzentration von GLDH verhält, mit Aus- nahme während der Behandlung mit CCl4. Hierbei erhöhte sich die Konzentration von GLDH mit verlängerter Behandlungszeit immer weiter, während der OPN-Gehalt gleich hoch blieb. Da in diesem Tiermodell eine erhöhte Konzentration von OPN bei medikamentöser Behandlung beobachtet wurde, könnte OPN als translationaler Im- munreaktionsmarker für DILI dienen. HMGB1 stellt eher einen Biomarker für Leberfi- brose als für akutes Leberversagen dar, da die Behandlung mit APAP und DAPM einen gleichbleibenden HMGB1-Gehalt ergab, während Thioacetamid und CCl4 als bekannte Fibrose-induzierende Mittel zu erhöhter HMGB1-Konzentration in Plasma behandelter Ratten führten. In Übereinstimmung mit früheren RNA-Expressionsergebnissen wurde GLDH vorwiegend in der Leber, gefolgt von Nieren- und Hirngewebe, nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit zu einem besseren Verständnis der Verwendung von Trypsin in der IA-LC-MS/MS-Methodik und der Auswirkungen von Matrix und Probebearbeitung auf die potenziellen Biomarker für DILI beiträgt. Vor allem aber wird der Wert von GLDH und OPN als potenzielle Biomarker für DILI in Ratten als Tiermodell durch die hier erzielten Ergebnisse unterstützt, während HMGB1 als Marker für akute Leberschäden in Frage gestellt wird.