Mechanistic basis of shear-dependent cGMP signaling in platelets

Abstract

Cyclic guanosine 3’-5’-monophosphate (cGMP) is an intracellular second messenger which plays a pivotal role in many physiological processes. Drugs elevating cGMP levels have risen to prominence during the past century. The importance of the cGMP signaling pathway as a target for medical interventions is highlighted in the treatment of vasoconstrictive diseases, as increasing cGMP levels leads to relaxation of vascular smooth muscle cells. The most well-known cGMP drugs include Sildenafil (Viagra®) and Riociguat (Adempas®) which are used to treat erectile dysfunction and alleviate pulmonary hypertension, respectively. In mammals, two types of guanylyl cyclases are responsible for the generation of cGMP: A membrane-bound particulate guanylyl cyclase (pGC) which is activated by, e.g., natriuretic peptides, and a nitric oxide (NO)-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC). Both types of cyclases transform 5’-GTP to cGMP, which leads to activation of different downstream effectors. Many cGMP-induced physiological effects are mediated by the cGMP-dependent protein kinase type I (cGKI). In platelets (thrombocytes), the NO/NO-GC/cGMP/cGKI signaling pathway plays an important role in hemostasis. In the cardiovascular system, NO is continuously released from endothelial cells into the circulation, leading to activation of NO-GC in platelets, generation of cGMP, activation of cGKI, and inhibition of platelet aggregation. This prevents an excessive activation of platelets and reduces the risk of developing dangerous thrombi.

In a previous study from our working group, it was shown that NO-induced generation of cGMP in platelets is shear-dependent (“mechano-cGMP”). In the first part of this work, we sought to gain insights into the mechanistic basis of mechano-cGMP and identify the mechanoreceptor which converts shear stress, a physical force, into a biochemical cGMP signal. We used classical biochemical methods such as cell fractionation, Western blotting, co-immunoprecipitation, and mass spectrometry, combined with state-of-the-art live-cell imaging approaches that allow for the observation of cGMP signals in real time. We hypothesized that a cGMP signaling complex is present at the inner leaflet of the platelet plasma membrane. To test this hypothesis, we fractionated human platelets into cytosolic and membrane fractions. In the latter, we detected the presence of both the NO GC and cGKI. Furthermore, we showed a physical interaction between these two proteins at the platelet membrane via co-immunoprecipitation. To identify more components of the cGMP signalosome, especially potential mechanoreceptors, we analyzed the co-immunoprecipitates of membrane fractions via mass spectrometry and detected several integrins. Integrins are important relays between cells and their environment and have also been described as mechanoreceptors. We therefore tested several integrins for a functional connection to shear-dependent cGMP signaling in platelets. Using platelets from transgenic mice expressing a Förster resonance energy transfer (FRET)-based cGMP biosensor (cGi500), we discovered that inhibition of integrin αIIb, β3 or β1 attenuated the mechanosensitive cGMP response. In sum, we have identified a membrane-associated cGMP signaling complex containing the NO-GC and cGKI, with integrins serving as mechanotransducers for shear stress. In the presence of NO and mechanical force, the cGMP signalosome generates cGMP leading to the inhibition of platelet aggregation.

In the second part of this work, we explored the pharmacological relevance of mechano-cGMP in platelets. Using the murine in vivo cremaster model, we studied whether the NO-GC stimulator Riociguat affects thrombus development. While Riociguat treatment had no significant effect on initial thrombus growth, it promoted the dissolution of thrombi. Pharmacologically increasing cGMP via drugs to achieve an antithrombotic effect could be advantageous compared to established anticoagulants, as the initial aggregation and sealing process of a vascular lesion is not inhibited due to low shear conditions during this phase. As soon as the developing thrombus grows and platelets in the thrombus are exposed to increasing shear stress, cGMP levels increase and limit thrombus growth. Thus, the mechano-cGMP pathway in platelets may play an important role in the treatment of cardiovascular disease, as its pharmacological activation could minimize both the risk of bleeding and thrombosis.

Cyclisches Guanosin 3’-5’-Monophosphat (cGMP) ist ein intrazellulärer sekundärer Botenstoff, der in zahlreichen physiologischen Prozessen eine wesentliche Rolle spielt. Der cGMP Signalweg dient schon seit mehr als einem Jahrhundert als Ziel von medikamentöser Intervention. Seine enorme Wichtigkeit macht man sich v.a. bei vasokonstriktiven Erkrankungen zu Nutze, da eine Erhöhung von cGMP zu einer Relaxation von Glattmuskelzellen führt. Zu den prominentesten cGMP-modulierenden Pharmaka gehören Sildenafil (Viagra®) für die Behandlung von erektiler Dysfunktion und Riociguat (Adempas®), welches bei pulmonaler Hypertension eingesetzt wird. In Säugetieren sind zwei Typen von Guanylylcyclasen für die Generierung von cGMP verantwortlich: Eine membrangebundene partikuläre Guanylylcyclase (pGC), welche u.a. von natriuretischen Peptiden aktiviert wird, und eine für Stickstoffmonoxid (NO) sensitive Guanylylcyclase (NO-GC). Beide Guanylylcyclasen katalysieren die Umwandlung von 5’GTP zu cGMP, welches an mehrere Effektoren binden und diese aktivieren kann. Häufig wird hierbei die cGMP-abhängige Proteinkinase Typ I (cGKI) aktiviert. Diese vermittelt schlussendlich viele der physiologischen Effekte des cGMP-Signalwegs. In Blutplättchen (Thrombozyten) spielt der NO/NO-GC/cGMP/cGKI-Signalweg eine bedeutende Rolle zur Erhaltung der Hämostase. Im kardiovaskulären System wird von Endothelzellen ständig NO freigesetzt, welches in Blutplättchen die Generierung von cGMP durch die NO-GC und Aktivierung der cGKI zur Folge hat. Dies führt zu einer Inhibierung der Plättchenaggregation und somit wird eine überschießende Aktivierung der Plättchen verhindert und das Thromboserisiko gesenkt. Unsere Arbeitsgruppe hat bereits gezeigt, dass die NO-induzierte Bildung von cGMP in Blutplättchen von Scherkräften abhängig ist („mechano-cGMP“). Im ersten Teil dieser Arbeit galt es, die mechanistische Basis von mechano-cGMP näher aufzuklären und den Mechanorezeptor zu identifizieren, der die physikalische Scherkraft in ein biochemisches cGMP-Signal umwandelt. Hierfür wurden klassische biochemische Methoden wie Zellfraktionierung, Western Blots, Co-Immunopräzipitationen und Massenspektrometrie mit modernen live-cell-imaging Methoden kombiniert, die es erlauben cGMP-Veränderungen in Echtzeit zu beobachten. Wir nahmen zunächst an, dass sich ein cGMP-Signalkomplex an der Innenseite der Plasmamembran der Blutplättchen befindet, auf den Scherkräfte einwirken. Um dies zu verifizieren, wurden humane Blutplättchen in Cytosol- und Membranfraktion getrennt. In letzterer wurde nicht nur die Anwesenheit von cGKI und NO-GC detektiert, sondern auch eine physikalische Interaktion dieser beiden Proteine mittels Co-Immunopräzipitation nachgewiesen. Um weitere Komponenten des cGMP-Signalkomplexes, v.a. potenzielle Mechanorezeptoren, zu identifizieren, wurden die Co-Immunopräzipitate der Membranfraktionen mithilfe der Massenspektrometrie analysiert. Hierbei wurden mehrere Integrine nachgewiesen. Integrine spielen eine wichtige Rolle bei der Signalweiterleitung zwischen Zellen und deren Umgebung und wurden auch schon als Mechanorezeptoren beschrieben. Anschließend wurden die Blutplättchen auf einen möglichen funktionellen Zusammenhang zwischen Integrinen und dem cGMP-Signalweg untersucht. Mithilfe von transgenen Mäusen, die einen Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-basierten cGMP-Sensor (cGi500) exprimieren, konnte man beobachten, dass eine Inhibierung der Integrine αIIb, β3 und β1 zu einer Verminderung des mechanosensitiven cGMP-Signals führt. Insgesamt weisen diese Daten auf einen membran-assoziierten cGMP-Signalkomplex in Blutplättchen hin, in dem sich sowohl die NO-GC, als auch die cGKI befinden. Zudem fungieren Integrine in diesem Signalkomplex mutmaßlich als Mechanosensor und führen als Antwort auf NO und Scherkräfte zur Bildung von cGMP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde auf die pharmakologische Relevanz des mechano-cGMP-Signalwegs in Blutplättchen eingegangen. Hierzu wurde in vivo im sog. Cremaster-Modell der Maus die Wirkung des NO-GC-Stimulators Riociguat auf die Thrombusentwicklung untersucht. Es wurde beobachtet, dass unter Gabe von Riociguat Thromben zwar initial ähnlich wuchsen wie unter Kontrollbedingungen, sich jedoch schneller wieder auflösten. Dieser antithrombotische Effekt eines cGMP-erhöhenden Pharmakons könnte einen Vorteil gegenüber den heutzutage gängigen Antikoagulanzien mit sich bringen: Das initiale Wachstum des Thrombus nach einer Gefäßverletzung wird aufgrund geringer Scherkräfte in dieser Phase nicht inhibiert. Sobald jedoch der Thrombus wächst und höhere Scherkräfte auf ihn einwirken, bremst der cGMP-Signalweg das übermäßige Wachstum des Thrombus. Zukünftig könnte der mechano-cGMP-Signalweg bei der Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen wichtig werden, da durch seine pharmakologische Aktivierung sowohl das Blutungs- als auch das Thromboserisiko minimiert werden könnte.