Biosynthesis of the allelopathic inhibitor 7-deoxysedoheptulose in Synechococcus elongatus PCC 7942 and its mode of inhibition in the shikimate pathway

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dc.contributor.advisor Forchhammer, Karl (Prof. Dr.)
dc.contributor.author Rapp, Johanna
dc.date.accessioned 2021-10-12T15:23:24Z
dc.date.available 2021-10-12T15:23:24Z
dc.date.issued 2021-10-12
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10900/119567
dc.identifier.uri http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-1195676 de_DE
dc.identifier.uri http://dx.doi.org/10.15496/publikation-60940
dc.description.abstract Cyanobakterien sind Produzenten einer Vielzahl von Sekundärmetaboliten mit verschiedenen Funktionen. Dazu zählt beispielsweise auch die Synthese allelopathischer Inhibitoren, die in der gleichen ökologischen Nische lebende Organismen hemmen. Üblicherweise werden solche Metaboliten von filamentösen Cyanobakterien mittels großer Gencluster hergestellt. Überraschenderweise wurde kürzlich ein bioaktiver Desoxy-Zucker, genauer 7-Desoxysedoheptulose (7dSh), aus dem Kulturüberstand des einzelligen Cyanobakteriums Synechococcus elongatus PCC 7942 (S. elongatus) isoliert. In der vorliegenden Arbeit wurde durch die Analyse des Kulturüberstandes mittels Gaschromatographie-gekoppelter Massenspektrometrie, Fütterungsexperimenten, sowie Knockout Mutanten der Biosyntheseweg von 7dSh aufgeklärt. Dieses leitet sich von 5-Desoxyadenosin (5dAdo) ab, einem inhibitorischen Nebenprodukt radikalischer SAM Enzyme, die in allen drei Domänen des Lebens vorkommen. 5dAdo wird dabei lediglich durch promiskuitive Aktivität von Enzymen des Primärstoffwechsels metabolisiert. Dies führt zunächst zu einer Ausscheidung und Akkumulation von 5-Desoxyribose, gefolgt von einer Anreicherung von 7dSh. Da S. elongatus ein kleines Genom ohne kanonische Gencluster für die Sekundärmetabolitsynthese besitzt, erlaubt diese Strategie die Synthese eines bioaktiven Moleküls direkt aus einem „Abfall“-Produkt des Primärstoffwechsels. Dies findet vollständig durch promiskuitive Enzymaktivitäten statt, ohne dass daran ein spezifisches Gencluster involviert wäre. Diese Entdeckung stellt die klassische Sicht auf die Synthese von Sekundärmetaboliten als Produkte spezifischer Gencluster in Frage und erweitert damit die Bandbreite an bioaktiven Molekülen. Neben der Aufklärung des Biosyntheseweges von 7dSh wurde hiermit auch ein alternativer Recyclingweg für 5dAdo, der bisher noch nicht bekannt war, beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde außerdem das Zielenzym von 7dSh in der Zelle, die Dehydrochinat-Synthase, das zweite Enzym des Shikimatwegs, bestätigt. Durch die Entwicklung eines in vitro Inhibitionsassays mit aufgereinigtem Enzym konnte gezeigt werden, dass dieses Molekül die DHQS kompetitiv hemmt. Dabei liegen die Inhibitionskonstante wie auch der IC50-Wert im niedrigeren µM Bereich. 7dSh inhibiert das Wachstum verschiedener Cyanobakterien. Es kann aber auch das Wachstum auskeimender Pflanzen auf Erde hemmen, was für eine potenzielle Verwendung als Herbizid sprechen könnte. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die hemmende Wirkung von 7dSh auf Anabaena variabilis ATCC 29413 und Synechocystis sp. PCC 6803 über eine effektive und rasche Aufnahme mittels strukturell verschiedener, promiskuitiver Zuckertransporter zustande kommt. Beteiligt daran sind ein Fructose ABC-Transporter bzw. eine Glucose-Permease. Spontane Mutationen im jeweiligen Kohlenhydrattransporter führen zu einem Verlust der 7dSh-Sensitivität, gehen aber auch mit einem Verlust der Fähigkeit des heterotrophen Wachstums einher. Aufgrund dieser Ergebnisse wird angenommen, dass 7dSh der erste allelopathische Inhibitor des Shikimatwegs ist, welcher S. elongatus in der Verteidigung seiner ökologischen Nische unterstützt. de_DE
dc.description.abstract Cyanobacteria are known as producers of a wide range of secondary metabolites with various functions. This includes the synthesis of allelopathic inhibitors, which suppress the growth of other organisms within the same ecological niche. These compounds are usually produced by filamentous cyanobacteria via huge gene clusters. Nevertheless, a bioactive deoxy-sugar, namely 7-deoxysedoheptulose (7dSh), was recently isolated from the culture supernatant of the unicellular cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 (S. elongatus). In this work the biosynthetic pathway of 7dSh formation was elucidated by means of supernatant analysis via gas chromatography-mass spectrometry, feeding experiments and knockout mutants. 7dSh derives from 5-deoxyadenosine (5dAdo), an inhibitory by-product of radical SAM enzymes, which are present in all domains of life. 5dAdo is metabolized by solely promiscuous activity of enzymes of the primary metabolism, resulting in the excretion first of 5-deoxyribose and subsequently of 7dSh into the culture supernatant. This strategy enables S. elongatus, which has a small, stream-lined genome lacking canonical gene clusters for the synthesis of secondary metabolites, to produce an allelopathic inhibitor from a “waste” product of primary metabolism by enzymatic promiscuity, without involving a specific gene cluster. This discovery challenges the view on the biosynthesis of bioactive molecules as sole products of biosynthetic gene clusters and expands the range of bioactive compounds which can be synthesized. Additionally, with the elucidation of the biosynthesis of 7dSh, an alternative pathway for 5dAdo salvage was discovered, which had previously not been described. In the second part of this work, the intracellular target of 7dSh, the dehydroquinate synthase, which is the second enzyme of the shikimate pathway, was confirmed. By the development of an in vitro inhibition assay using purified enzyme, it was shown that 7dSh inhibits the enzyme in a competitive manner, with an inhibition constant as well as an IC50-value in the lower µM range. Besides the inhibition of other cyanobacteria, 7dSh also inhibits the growth of germinating plant seedlings on soil, indicating that it might be used as an herbicide. Furthermore, it was shown that in Anabaena variabilis ATCC 29413 and Synechocystis sp. PCC 6803, the inhibitory effect of this molecule is correlated with an effective uptake via structurally different, promiscuous sugar transporters – a fructose ABC-transporter or a glucose permease. Spontaneous mutations in these transport proteins can result in the loss of 7dSh sensitivity, however the capability of heterotrophic growth is disabled at the same time. 7dSh can therefore be assumed to represent the first allelopathic inhibitor targeting the shikimate pathway, supporting S. elongatus in its niche competition. en
dc.language.iso en de_DE
dc.publisher Universität Tübingen de_DE
dc.rights ubt-podok de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en en
dc.subject.classification Mikrobiologie , Cyanobakterien , Sekundärstoffwechsel , Allelopathie , Promiskuität , Inhibitor de_DE
dc.subject.ddc 500 de_DE
dc.subject.ddc 570 de_DE
dc.subject.other Mikrobiologie de_DE
dc.subject.other Cyanobakterien de_DE
dc.subject.other Cyanobacteria en
dc.subject.other 7-deoxysedoheptulose en
dc.subject.other 7-Desoxysedoheptulose de_DE
dc.subject.other Shikimat-Weg de_DE
dc.subject.other Shikimate pathway en
dc.subject.other 5-deoxyribose en
dc.subject.other 5-Desoxyribose de_DE
dc.subject.other 5-deoxyadenosine en
dc.subject.other 5-Desoxyadenosine de_DE
dc.subject.other Salvage pathway en
dc.subject.other Salvage Pathway de_DE
dc.subject.other Allelopathie de_DE
dc.subject.other Allelopathy en
dc.subject.other Synechococcus elongatus PCC 7942 de_DE
dc.subject.other Synechococcus elongatus PCC 7942 en
dc.subject.other Bioaktive Substanzen de_DE
dc.subject.other bioactive compounds en
dc.subject.other Enzyme promiscuity en
dc.subject.other Enzym Promiskuität de_DE
dc.subject.other Microbiology en
dc.title Biosynthesis of the allelopathic inhibitor 7-deoxysedoheptulose in Synechococcus elongatus PCC 7942 and its mode of inhibition in the shikimate pathway en
dc.type Dissertation de_DE
dcterms.dateAccepted 2021-09-08
utue.publikation.fachbereich Biologie de_DE
utue.publikation.fakultaet 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät de_DE
utue.publikation.noppn yes de_DE

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