Needle length control and secretion specificity switching in bacterial T3SS

Abstract

Type III secretion systems (T3SS) or injectisomes are one of the most investigated bacterial secretions systems, as they are pivotal for the virulence of several animal and plant pathogens. The T3SS consist of a membrane embedded base that harbors the export apparatus, cytoplasmic components involved in secretion of proteins, a needle filament and a translocation pore inserted in the host cell membrane. Proteins secreted in type 3-dependent manner, also called substrates, are classified in three categories: early, middle and late, according to the order in which they are transported. Assembly of the needle structure requires the secretion of three early substrates: the needle (SctF), the rod (SctI) and the needle length regulator (SctP). As soon as the needle reaches its predetermined length, the T3SS switches its substrate specificity and allows the secretion of middle and late substrates to complete assembly of the injectisome. SctI and inner rod assembly are suggested to be involved in specificity switching and needle length control, respectively. Efficient assembly and functionality of the injectisome is assured by the ordered secretion of proteins and the needle length regulation, both processes governed by complex mechanisms that are not fully elucidated. The aim of this study was to improve the understanding of the molecular basis of needle length control and its relationship with substrate specificity switching by I) creating a genetic system to synchronize assembly of the T3SS, and II) characterizing the assembly and interaction network of SctI via in vivo photocrosslinking. This study provides an elaborate genetic system that permits to synchronize assembly of the injectisome. Although this system is not suitable for structural analyses, it is amenable to integration of further approaches, which makes it a resourceful tool to investigate relevant processes involved in the assembly and function regulation of the injectisome. In addition, this work encompasses a comprehensive network of protein-protein interactions between SctI and the export apparatus components SctR and SctT. These data point toward the adapter function of the inner rod between these two structures and therefore we propose to rename the inner rod “needle adapter”. Finally, this study provides experimental evidence that assembly of the inner rod is not involved in neither specificity switch nor in needle length control.

Das Typ III Sekretionssystem (T3SS) oder Injektisom ist eines der bestuntersuchten bakteriellen Sekretionssysteme, da es von entscheidender Wichtigkeit für die Virulenz einer Vielzahl von Pflanzen- und Tierpathogenen ist. Die Struktur des T3SS setzt sich zusammen aus der Basis, die in die bakterielle Zellhülle eingebettet ist und den Exportapparat beherbergt, zytoplasmatischen Bestandteilen, die an der Sekretion von Substraten beteiligt sind, dem Nadelfilament, und einer Translokationspore, die in die Membran der Wirtszelle eingebaut wird. Proteinsubstrate des T3SS werden nach ihrer Sekretionsreihenfolge in frühe, intermediäre und späte Substrate untergliedert. Der Aufbau des Nadelfilaments erfolgt durch Sekretion von drei frühen Substraten: der Nadeluntereinheit (SctF), dem Nadeladapter (SctI) sowie dem Nadellängenregulationsprotein (SctP). Sobald das Nadelfilament eine vorbestimmte Länge erreicht hat, ändert das T3SS seine Substratspezifität, um den Transport von intermediären und späten Substraten zu ermöglichen und den Aufbau des Injektisoms abzuschließen. Es wird vermutet, dass SctI und die Assemblierung des Nadeladapters beim Substratspezifitätswechsel sowie bei der Nadellängenkontrolle eine Rolle spielen. Obwohl die Aufrechterhaltung der Sekretionsreihenfolge und die Kontrolle der Nadellänge entscheidend für einen effizienten Aufbau und korrektes Funktionieren des T3SS sind, konnten die komplexen Mechanismen, die diese Prozesse steuern, bislang nicht abschließend aufgeklärt werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein besseres Verständnis des molekularen Mechanismus der Nadellängenkontrolle und deren Verbindung zum Substratspezifitätswechsel zu erlangen, indem I) ein genetisches System zur Synchronisierung des Aufbaus des T3SS konstruiert wird, und II) der Zusammenbau und das Interaktionsnetzwerk von SctI mittels in vivo photocrosslinking untersucht wird. Das im Rahmen dieser Arbeit erzeugte genetische System erlaubt es, den Zusammenbau des Injektisoms präzise zu steuern und zu synchronisieren. Wenngleich dieses System nicht direkt zur Strukturaufklärung geeignet ist, stellt es ein vielseitiges Werkzeug für zukünftige Studien des Aufbaus und der Regulation der Funktion des Injektisoms dar. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit ein umfassendes Netzwerk von Protein Protein-Interaktionen zwischen SctI und den Exportapparatkomponenten SctR und SctT beschrieben werden. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass SctI als Adapter zwischen dem Exportapparat und dem Nadelfilament dient, weshalb wir vorschlagen, SctI fortan als Nadeladapter zu bezeichnen. Zuletzt konnte experimentell gezeigt werden, dass der Zusammenbau des Nadeladapters weder bei der Nadellängenkontrolle noch beim Wechsel der Substratspezifität eine Rolle spielt.