TNF-α & IFN-γ vermittelte Seneszenz bei Neuroblastomzelllinien

Abstract

Eine Krebserkrankung ist bei Kindern in den Industrieländern die zweithäufigste Todesursache. Jedes Jahr erkranken ca. 1800 Kinder unter 15 Jahren in Deutschland neu an einer Krebserkrankung. Mit 7% der Krebserkrankungen macht das Neuroblastom eine relativ große Gruppe der Tumoren im Kindesalter aus. Hinzu kommt außerdem, dass ein Neuroblastom häufig erst sehr spät diagnostiziert wird, da bei den Kindern sehr wenige Symptome auftreten. Wenn der Tumor dann entdeckt wird, ist er meist schon sehr groß und bereits metastasiert, sodass die Kinder eine schlechte Prognose haben. Um in Zukunft vielleicht bessere Therapieoptionen für die Behandlung des Neuroblastoms zu entwickeln, beschäftigt sich diese Arbeit mit dem Titel: TNF-α & IFN-γ vermittelte Seneszenz bei Neuroblastomzelllinien, im Gebiet der Grundlagenforschung mit einer möglichen Seneszenzinduktion bei Neuroblastomzelllinien durch die Zytokine TNF-α und IFN-γ. Im Rahmen dieser Arbeit wurden sieben unterschiedliche Neuroblastomzelllinien (LS, SH-SY5Y, LAN-1, Kelly, SK-N-AS, SK-N-BE(2) und SHEP) in verschiedenen Assay und unter Anwendung verschiedener Methoden auf eine Induktion einer Seneszenz durch die Zugabe von TNF-α und IFN-γ hin untersucht. An erster Stelle steht hier die Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase Färbung. Mit dieser Färbung kann der Seneszenz-assoziierte Biomarker β-Galactosidase nachgewiesen werden. Für keine der Neuroblastomzelllinien konnte eine Färbung beobachtet werden. Das EdU Assay dient zur Untersuchung der Zellzyklusphasen nach Behandlung der Zellen mit den Zytokinen. Im Weiteren wurde eine CFSE-Färbung der Zellen durchgeführt, um die Proliferation zu beurteilen. Außerdem wurde im Rahmen dieses Assays die Entwicklung der Proliferation im Verlauf der Behandlung dokumentiert. Das durchgeführte Growth Assay diente zur Untersuchung des Verhaltens der Zellen nach zweifacher Behandlung der Zellen mit den Zytokinen TNF-α und IFN-γ und nachfolgender Wegnahme der Zytokine. Die Auswirkung unterschiedlicher Konzentrationen von TNF-α auf die Proliferation einiger Neuroblastomzelllinien wurde mit Hilfe des Luciferase Assays untersucht. Für eine kontinuierliche Beurteilung der Konfluenz und so der Proliferation der Zellen über den kompletten Zeitraum der Behandlung wurde ein IncuCyte® Assay durchgeführt. Außerdem wurde versucht eine Immunfluoreszenzfärbung für diese Neuroblastomzelllinien zu etablieren, um so eine Veränderung der Proliferationsmarker Ki67 und PCNA und der Tumorsupressorproteine p16INK4A und HP1-γ zwischen der Kontrollgruppe und der behandelten Gruppe nachzuweisen. Die Methode konnte im Rahmen dieser Arbeit leider nicht etabliert werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass folgende Zelllinien als seneszent angesehen werden können: LS und SHEP. Diese beiden Zelllinien zeigten in allen durchgeführten Assays, bis auf die β-Galactosidase-Färbung, eine Seneszenz, eine Inhibition des Zellzyklus oder eine verminderte Proliferation. Auch die Zelllinie SH-SY5Y zeigt in vielen Assays einen Hinweis auf eine Seneszenz. Im EdU Assay wurde eine Inhibition des Zellzyklus beobachtet, jedoch wurde hier auch ein großer Anteil apoptotischer Zellen detektiert. In der CFSE-Färbung wurde eine Seneszenz und im IncuCyte® Assay eine verminderte Proliferation beobachtet. Im Growth Assay wurde eine partielle Seneszenz nachgewiesen. Das Luciferase Assay war nicht verwertbar. Für die Zelllinie SH-SY5Y sollte generell genau differenziert werden, ob eine mögliche Seneszenz vorliegt, oder ob ein großer Teil der Zellen durch die Behandlung apoptotisch wird. Die Zelllinien LAN-1, Kelly und SK-N-AS können als partiell seneszent angesehen werden. Wenn man alle Assays zusammen betrachtet, zeigte die Zelllinien LAN-1 in einem Teil der Assays kleine Hinweise für eine Seneszenz. Für die Zelllinie LAN-1 konnte im Growth Assay eine partielle Seneszenz und im EdU Assay eine geringe Inhibition des Zellzyklus festgestellt werden. Die CFSE-Färbung zeigte keine Seneszenz. Im Luciferase Assay und im IncuCyte® Assay wurde keine Veränderung der Proliferation in der behandelten Gruppe detektiert. Die Zelllinie Kelly zeigte im Growth Assay eine Seneszenz und im EdU Assay eine geringe Inhibition des Zellzyklus. Im Luciferase Assay und im IncuCyte® Assay konnte keine Veränderung in der Proliferation detektiert werden. Keine Seneszenz zeigte die Zelllinie Kelly außerdem in der CFSE Färbung. Im EdU Assay zeigte die Zelllinie SK-N-AS eine Inhibition des Zellzyklus. In der CFSE-Färbung konnte eine partielle Seneszenz nachgewiesen werden. Die Neuroblastomzelllinie SK-N-AS zeigte weder im Growth Assay eine Seneszenz noch im IncuCyte® Assay eine verminderte Proliferation. Die Zelllinie SK-N-BE(2) zeigte in keinem der Assays eine Seneszenz. In Zukunft kann diese Arbeit als Grundlage für weitere Assays angesehen werden. Dennoch können die Ergebnisse weiter verifiziert werden und in neuen Bereichen weitere Forschungsarbeiten initiiert werden.