Inhaltszusammenfassung:
Eine Krebserkrankung ist bei Kindern in den Industrieländern die zweithäufigste
Todesursache. Jedes Jahr erkranken ca. 1800 Kinder unter 15 Jahren in
Deutschland neu an einer Krebserkrankung. Mit 7% der Krebserkrankungen
macht das Neuroblastom eine relativ große Gruppe der Tumoren im Kindesalter
aus. Hinzu kommt außerdem, dass ein Neuroblastom häufig erst sehr spät
diagnostiziert wird, da bei den Kindern sehr wenige Symptome auftreten. Wenn
der Tumor dann entdeckt wird, ist er meist schon sehr groß und bereits
metastasiert, sodass die Kinder eine schlechte Prognose haben.
Um in Zukunft vielleicht bessere Therapieoptionen für die Behandlung des
Neuroblastoms zu entwickeln, beschäftigt sich diese Arbeit mit dem Titel: TNF-α
& IFN-γ vermittelte Seneszenz bei Neuroblastomzelllinien, im Gebiet der
Grundlagenforschung mit einer möglichen Seneszenzinduktion bei
Neuroblastomzelllinien durch die Zytokine TNF-α und IFN-γ.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sieben unterschiedliche
Neuroblastomzelllinien (LS, SH-SY5Y, LAN-1, Kelly, SK-N-AS, SK-N-BE(2) und
SHEP) in verschiedenen Assay und unter Anwendung verschiedener Methoden
auf eine Induktion einer Seneszenz durch die Zugabe von TNF-α und IFN-γ hin
untersucht.
An erster Stelle steht hier die Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase Färbung.
Mit dieser Färbung kann der Seneszenz-assoziierte Biomarker β-Galactosidase
nachgewiesen werden. Für keine der Neuroblastomzelllinien konnte eine
Färbung beobachtet werden.
Das EdU Assay dient zur Untersuchung der Zellzyklusphasen nach Behandlung
der Zellen mit den Zytokinen.
Im Weiteren wurde eine CFSE-Färbung der Zellen durchgeführt, um die
Proliferation zu beurteilen. Außerdem wurde im Rahmen dieses Assays die
Entwicklung der Proliferation im Verlauf der Behandlung dokumentiert.
Das durchgeführte Growth Assay diente zur Untersuchung des Verhaltens der
Zellen nach zweifacher Behandlung der Zellen mit den Zytokinen TNF-α und
IFN-γ und nachfolgender Wegnahme der Zytokine.
Die Auswirkung unterschiedlicher Konzentrationen von TNF-α auf die
Proliferation einiger Neuroblastomzelllinien wurde mit Hilfe des Luciferase
Assays untersucht.
Für eine kontinuierliche Beurteilung der Konfluenz und so der Proliferation der
Zellen über den kompletten Zeitraum der Behandlung wurde ein IncuCyte®
Assay durchgeführt.
Außerdem wurde versucht eine Immunfluoreszenzfärbung für diese
Neuroblastomzelllinien zu etablieren, um so eine Veränderung der
Proliferationsmarker Ki67 und PCNA und der Tumorsupressorproteine p16INK4A
und HP1-γ zwischen der Kontrollgruppe und der behandelten Gruppe
nachzuweisen. Die Methode konnte im Rahmen dieser Arbeit leider nicht
etabliert werden.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass folgende Zelllinien als seneszent
angesehen werden können: LS und SHEP. Diese beiden Zelllinien zeigten in
allen durchgeführten Assays, bis auf die β-Galactosidase-Färbung, eine
Seneszenz, eine Inhibition des Zellzyklus oder eine verminderte Proliferation.
Auch die Zelllinie SH-SY5Y zeigt in vielen Assays einen Hinweis auf eine
Seneszenz. Im EdU Assay wurde eine Inhibition des Zellzyklus beobachtet,
jedoch wurde hier auch ein großer Anteil apoptotischer Zellen detektiert. In der
CFSE-Färbung wurde eine Seneszenz und im IncuCyte® Assay eine
verminderte Proliferation beobachtet. Im Growth Assay wurde eine partielle
Seneszenz nachgewiesen. Das Luciferase Assay war nicht verwertbar. Für die
Zelllinie SH-SY5Y sollte generell genau differenziert werden, ob eine mögliche
Seneszenz vorliegt, oder ob ein großer Teil der Zellen durch die Behandlung
apoptotisch wird.
Die Zelllinien LAN-1, Kelly und SK-N-AS können als partiell seneszent
angesehen werden. Wenn man alle Assays zusammen betrachtet, zeigte die
Zelllinien LAN-1 in einem Teil der Assays kleine Hinweise für eine Seneszenz.
Für die Zelllinie LAN-1 konnte im Growth Assay eine partielle Seneszenz und
im EdU Assay eine geringe Inhibition des Zellzyklus festgestellt werden. Die
CFSE-Färbung zeigte keine Seneszenz. Im Luciferase Assay und im IncuCyte®
Assay wurde keine Veränderung der Proliferation in der behandelten Gruppe
detektiert. Die Zelllinie Kelly zeigte im Growth Assay eine Seneszenz und im
EdU Assay eine geringe Inhibition des Zellzyklus. Im Luciferase Assay und im
IncuCyte® Assay konnte keine Veränderung in der Proliferation detektiert
werden. Keine Seneszenz zeigte die Zelllinie Kelly außerdem in der CFSE Färbung. Im EdU Assay zeigte die Zelllinie SK-N-AS eine Inhibition des
Zellzyklus. In der CFSE-Färbung konnte eine partielle Seneszenz
nachgewiesen werden. Die Neuroblastomzelllinie SK-N-AS zeigte weder im
Growth Assay eine Seneszenz noch im IncuCyte® Assay eine verminderte
Proliferation.
Die Zelllinie SK-N-BE(2) zeigte in keinem der Assays eine Seneszenz.
In Zukunft kann diese Arbeit als Grundlage für weitere Assays angesehen
werden. Dennoch können die Ergebnisse weiter verifiziert werden und in neuen
Bereichen weitere Forschungsarbeiten initiiert werden.
