Thermofluorimetric, magnetic and lateral flow aptamer based assays for point of care applications

Abstract

Diagnostische Tests werden üblicherweise in zentralen Labors durchgeführt. Sie stützen sich auf hochentwickelte Analysemethoden, die teure und sperrige Geräte sowie hochqualifiziertes Personal erfordern. Andererseits bietet der Point-of-Care eine Alternative für eine schnelle, einfache und erschwingliche Diagnostik und ermöglicht so eine frühzeitige medizinische Intervention und ein besseres klinisches Ergebnis. Bislang hat das Point-of-Care-System an der Front der kleinen Moleküle versagt. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die meisten Point-of-Care-Assays auf Immunoassays basieren. Die Quantifizierung von kleinen Molekülen auf der Basis von Antikörpern bleibt aufgrund ihrer intrinsischen Eigenschaften und der Nichtverfügbarkeit verschiedener Bindungsepitope eine Herausforderung. Dies beschränkt die verfügbaren Formate auf kompetitive Assays mit den damit verbundenen Nachteilen, z.B. umgekehrt proportionales Signal und Schwierigkeit der Markierung von Zielmolekülen. Im Gegensatz dazu bieten Aptamere alternative Detektionsformate, die die Gestaltung von Point-of-Care für kleine Moleküle ermöglichen könnten. Dennoch fehlte den bisherigen Ansätzen die erforderliche Einfachheit, Sensitivität, Multiplexing oder Hochdurchsatz. Obwohl die ersten beiden als Grundvoraussetzungen betrachtet werden, sind sie voneinander abhängig und in der Regel muss bei beiden ein Kompromiss eingegangen werden. Darauf aufbauend zielte diese Arbeit darauf ab, diese Engpässe durch verschiedene Strategien anzugehen. Im ersten Projekt wurden Aptamere mit einem qPCR-Instrument für ein Bench-Top-Hochdurchsatzverfahren für kleine Moleküle kombiniert. Durch die Messung des Schmelzpunktes der Aptamer-Beacons war eine Quantifizierung von Ethanolamin möglich. Im Gegensatz zum ELISA und anderen antikörperbasierten Ansätzen gibt es keine Wasch- oder Blockierungsschritte. Dies ist der erste Bericht über die Quantifizierung von kleinen Molekülen auf der Grundlage der Messung der Aptamer-Schmelztemperaturen. Die Bindung an das Target führt zu einer Stabilisierung der Struktur und einer entsprechenden Erhöhung der Schmelztemperatur. Obwohl der Assay einen hohen Durchsatz und eine hohe Empfindlichkeit bietet, ist er im Vergleich zu handgehaltenen Point-of-Care (POC)-Assays immer noch relativ komplex. Daher konzentrierte sich mein zweites Projekt auf einen handgehaltenen POC, für den keine Auslesegeräte erforderlich sind. Im zweiten Projekt lag der Schwerpunkt auf der Entwicklung einer einfachen, aber empfindlichen Plattform für kleine Moleküle (z.B. Ethanolamin) in einem ressourcenarmen Umfeld. Zu diesem Zweck wurden magnetische Partikel mit Ethanolamin-bindenden Aptameren funktionalisiert und in einer Kunststoff-Kapillar-Plattform verwendet. Der Assay basierte auf dem Strangverdrängungsformat und auf der Kapillaroberfläche wurden 3 Schichten aufgebaut. Zuerst wurden die Kapillaren mit einer Schicht aus verankernden Oligonukleotiden beschichtet. An diese Schicht wurden Aptamer-Magnetpartikel hybridisiert, wodurch die zweite Schicht entstand. Um freie (d.h. nicht hybridisierte) Aptamere zu vermeiden, wurden zusätzlich Oligonukleotid-magnetische Partikel an die von der Kapillaroberfläche abgewandten Aptamere hybridisiert. Wenn eine ethanolaminhaltige Probe eingeführt wird, werden die magnetischen Partikel verdrängt und mit einem Permanentmagneten aufgefangen. Dies führte zu einem visuell erkennbaren magnetischen Fleck. Durch die Kombination von Einfachheit und visueller Detektion ist dieser Assay ideal für den Einsatz bei geringen Ressourcen geeignet. Obwohl die ersten beiden Plattformen theoretisch in der Lage sind, multiplexen zu können, bleibt dies experimentell herausfordernd. Für die auf dem qPCR-Instrument basierende Methode benötigt man Aptamere mit signifikant unterschiedlichen Schmelztemperaturen. Alternativ könnte indirektes Multiplexing durch die Verwendung von kurzen Beacons erreicht werden, die um die Zielbindungsstelle konkurrieren. Dies erfordert jedoch eine vollständige Charakterisierung der Bindungsstruktur des Aptamers. Auf der anderen Seite wird die Kapillarplattform eine Farbkodierung der magnetischen Partikel benötigen. Dies ist bei den derzeitigen Technologien experimentell eine Herausforderung. Auf der Grundlage des vorhergehenden, zielte das dritte Projekt auf die Entwicklung eines POC mit Multiplexing-Fähigkeiten ab. Dementsprechend wurde ein Duplex-LFA entworfen, um Interleukin 6 (IL-6) und Thrombin gleichzeitig zu quantifizieren. Die Plattform bestand aus rot-emittierendem QD-Thrombin-bindendem Aptamer und grün emittierendem QD-IL-6-bindendem Antikörper, kombiniert mit einem Lateral Flow mit einer Streptavidin-Testlinie und Anti-Maus-Antikörper als Kontrolllinie. Der Ausleseaufbau basiert auf einem Smartphone, kombiniert mit einer 3D-gedruckten dunklen Box mit eingebautem UV-Licht. Dies ermöglichte den Nachweis beider Analyten auf derselben Testlinie, ohne dass physikalische Emissionsfilter erforderlich waren.

Diagnostic assays are commonly performed in central laboratories. They rely on sophisticated analytical methods requiring expensive and bulky equipment as well as highly trained personnel. On the other hand, point of care offers an alternative for fast turnaround, simple and affordable diagnostics, thus enabling early medical intervention and a better clinical outcome. So far, point of care has failed to deliver on the small molecules front. This is due to the fact that most point of care assays are based on immunoassays. Based on antibodies, the quantification of small molecules remains a challenge due to their intrinsic properties and the unavailability of different binding epitopes. This limits available formats to competitive assay with its associated drawbacks e.g. inversely proportional signal and difficulty of labeling target molecules. In contrast, aptamers offer alternative detection formats that could enable the design of point of care for small molecules. Nevertheless, previous approaches lacked the required simplicity, sensitivity, multiplexing, or high-throughput. Although the first two are considered basic requirements, they are dependent and usually, a compromise has to be made on either. Building on this, this work aimed to tackle these bottlenecks through different strategies. In the first project, aptamers were combined with a qPCR instrument for a bench-top high-throughput method for small molecules. Through measuring the melting point of the aptamer beacons, a quantification of ethanolamine was possible. Unlike ELISA and other antibody-based approaches, there are no washing or blocking steps. This is the first report on the quantification of small molecules based on measuring aptamer melting temperatures. Binding to the target results in a structure stabilization and a corresponding increase in the melting temperature. While the assay offers a high-throughput and sensitivity, it still is relatively complex in comparison to hand-held point of care (POC) assays. Therefore, my second project was focused on a hand-held POC with no readout devices necessary. In the second project, the focus was to design a simple yet sensitive platform for small molecules (e.g. ethanolamine) in a low resource setting. To this aim, magnetic particles were functionalized with ethanolamine binding aptamers and used in a plastic capillary platform. The assay was based on the strand displacement format and 3 layers were built on the capillary surface. Firstly, the capillaries were coated with a layer of anchoring oligonucleotides. To this layer aptamer-magnetic particles were hybridized resulting in the second layer. Additionally, to avoid free aptamers (i.e. not hybridized), oligonucleotide-magnetic particles were hybridized to the aptamers facing away from the capillary surface. When an ethanolamine containing sample is introduced, the magnetic particles are displaced and collected using a permanent magnet. This resulted in a visually detectable magnetic spot. The combination of simplicity and visual detection make this assay ideal for low resource settings. While the first two platforms are theoretically capable of multiplexing, this remains experimentally challenging. For the qPCR instrument based method, one will need aptamers with significantly different melting temperatures. Alternatively, indirect multiplexing could be achieved through the use of short beacons competing for the target binding site. However, this requires full characterization of the aptamer's binding structure. On the other hand, the capillary platform will need color coding of the magnetic particles. This is experimentally challenging giving the present technologies. Based on the previous, the third project aimed at developing a POC with multiplexing capabilities. Accordingly, a duplex LFA was designed to quantify interleukin 6 (IL-6) and thrombin simultaneously. The platform consisted of red-emitting QD-thrombin binding aptamer and green-emitting QD-IL-6 binding antibody, combined with a lateral flow with a streptavidin test line and anti-mouse antibody as a control line. The readout setup based on a smartphone combined with a 3D-printed dark box with a built-in UV light. This enabled detecting both analytes on the same test line without the need for physical emission filters.