Development of gene correction and supplementation therapy based on chemical modification and sequence optimized mRNA for monogenetic diseases

Abstract

Die Gentherapie wird als mögliche Therapieoption lebensverkürzender Erkrankungen (wie z.B. Cystische Fibrose (CF) oder β-Thalassämie) erwogen, welche bisher als unheilbar gelten. In den letzten 30 Jahren hat sich die Meinung über Gentherapie in der wissenschaftlichen Gemeinschaft stark gewandelt, vom zeitweiligen Stopp aller gentherapie-basierten klinischen Studien durch die US Food and Drug Administration (FDA) bis hin zu 9 erfolgreichen klinischen Studien in den letzten 5 Jahren. Ähnliches kann auch zum Thema RNA beobachtet werden: nach ihrer Entdeckung im Jahre 1961 galt RNA lange Zeit als zu instabil und zu immunogen für therapeutische Anwendungen. In der Tat kann RNA Immunreaktionen durch die Aktivierung sog. Pattern Recognition Rezeptoren (PRRs) wie Toll-like Rezeptoren (TLR3, TLR7 und TLR8) oder Protein Kinase R (PKR) hervorrufen. Hierzu wurden in letzten Jahren etwa 150 posttranskriptionelle chemische Modifikationen der 4 Basen der RNA beschrieben, die für eine höhere Variabilität und Einsatzfähigkeit von RNA sorgen. Diese Modifikationen beeinflussen sowohl die Interaktionen innerhalb der RNA (erhöhte Stabilität oder Flexibilität) als auch Interaktionen mit anderen Molekülen, wie z.B. PRRs (geringere Immunogenität). Auf Grund dieser Weiterentwicklungen konnte im Jahr 2016 die erste mRNA-basierte klinische Studie durchgeführt werden. Die Untersuchungen im Rahmen meiner Doktorarbeit geben einen Überblick über die Möglichkeiten wie mRNA für Gensupplementtherapien und Genkorrektur eingesetzt und zu diesem Zweck angepasst (mittels chemischer Modifikation und Sequenzoptimierung) werden kann. Als Beispiel für Gensupplementtherapie wurde ein mRNA Transkript des Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) Gens mithilfe von in vitro Transkription erstellt. Zusätzlich wurden Transkripte unter Verwendung von 2-Thiouridin (s2U), 5-Methylcytidin (m5C) und N1- Methylpseudouridin (m1Ψ) chemisch modifiziert. Chemisch modifizierte hCFTR mRNA (cmRNAhCFTR) zeigte eine signifikant höhere CFTR Expression und Funktionalität in CF Bronchialepithelzellen (CFBE41o-) im Vergleich zu unmodifizierter mRNA (mRNAhCFTR) und Plasmid-DNA (pDNAhCFTR). Im in vivo Cftr-/- Mausmodell konnte cmRNAhCFTR in Verbindung mit Chitosan-beschichteten poly-D, L-lactide-co-glycolide 75:25 (Resomer RG 752H) (PLGA) Nanopartikeln (NPs) eine drastische Verbesserung der Lungenfunktion erzielen. Die Einsekundenkapazität (FEV, bei Mäusen 0,1s, einer der wichtigsten Lungenfunktionsparameter zur Verlaufskontrolle bei CF Patienten) konnte im Vergleich zu mRNAhCFTR und pDNAhCFTR durch cmRNAhCFTR deutlich gesteigert werden. Dabei spielte der Administrationsweg (intravenös (i.v.) oder intratracheal (i.t.)) keine Rolle. Wie erwartet konnte 9 außerdem eine Verminderung der Immunantwort bei cmRNAhCFTR in in vivo und ex vivo Experimenten beobachtet werden. In einer zweiten Studie wurden mRNA Transkripte vom Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats (CRISPR) associated Protein 9 (Cas9) untersucht. CRISPR/Cas9 wurde hierbei zur Genkorrektur der Spleißvariante HBBIVS1-110 des β-Globin Gens, welche zur β- Thalassämie führt, genutzt. Im Vergleich zu anderen sequenzspezifischen Endonukleasen, Zink-Finger-Nukleasen (ZFN) und Transcription activator-like effector nucleases (TALENs), konnte eine höhere Aktivität bei Cas9 gemessen werden. Auch wenn Cas9 in Form von Plasmid-DNA noch keinen ausreichenden Prozentsatz an DNA-Doppelstrangbrüchen induzieren konnte, um Genkorrektur durch homologe Rekombination zu ermöglichen, konnte eine Reparatur des Gendefekts mithilfe von cmRNACas9 in K562 Zellen (immortalisierte myeloische Leukämie Zelllinie) und CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) nachgewiesen werden. Der Einfluss von Modifikationen auf die Effizienz von Cas9 mRNA wurde in einer weiteren Studie tiefergehend beleuchtet. Unter Zuhilfenahme der Degeneration des genetischen Codes wurde eine Sequenzoptimierung und insbesondere eine Verminderung des Uridingehaltes innerhalb des Cas9 mRNA Transkriptes vorgenommen ohne dabei die Aminosäuresequenz des Proteins zu ändern. Die Sequenzoptimierung der Cas9 mRNA konnte die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen im HBB Gen in CD34+ HSCs im Vergleich zur nicht-sequenzoptimierten Form weiter steigern. Außerdem konnte auch die Immunogenität der mRNA durch Sequenzoptimierung verringert und durch Verwendung von 5-Methoxyuridin (5moU) noch weiter minimiert werden. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit konnten innerhalb eines Review-Artikels in den wissenschaftlichen Kontext eingeordnet werden. Darüber hinaus weist dieser Artikel auf weiter zu beachtenden Faktoren, wie Administrationsformen, Eigenschaften von Transportmolekülen (NPs) und deren Formulierung hin. Außerdem zeigt der Artikel in diesem Zusammenhang die Bedeutung von chemischen Modifikationen und Sequenzoptimierung von mRNA als wichtiger Meilenstein in der Entwicklung von mRNA-basierten Therapien auf.