Optimierung von Kieferperiostzellen für das Knochen-Tissue Engineering: Herstellung von iPS-Zellen und Analyse von Progenitor-Oberflächenmarkern

Abstract

Die Knochengewebezüchtung im Labor (engl.: Bone Tissue Engineering, BTE) könnte in Zukunft autologe Knochentransplantate in der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie (MKGC) ersetzen. Für die Herstellung klinisch anwendbarer BTE- Produkte sind die Qualität und die Verfügbarkeit der dabei eingesetzten Stammzellen entscheidende Faktoren. Die Verfügbarkeit von Stammzellen ist einerseits durch die Größe der Gewebebiopsie, andererseits durch die Abnahme der Vitalität und des osteogenen Potenzials im Laufe der in vitro Kultivierung limitiert. Da für die Herstellung von BTE-Konstrukten zur Regeneration größerer Knochendefekte, z.B. nach Tumorresektionen, große Mengen osteogener Vorläuferzellen benötigt werden, sollten in der vorliegenden Arbeit induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus Kieferperiostzellen (JPCs) generiert, und als Zellquelle für das BTE etabliert werden. iPSCs besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind daher in großen Mengen verfügbar. Im Hinblick auf zukünftige klinische Anwendungen der Zellen, wurde zur Generierung von iPSCs eine besonders sichere xenogen-freie RNA-basierte Reprogrammierungstechnik entwickelt. Durch die Differenzierung von iPSCs zu MSC-ähnlichen Zellen (iMSCs) ist es möglich osteogene Vorläuferzellen herzustellen, welche analog zu normalen MSCs (mesenchymale Stamm-/Stromazellen) eingesetzt werden können. In der vorliegenden Arbeit wurden daher aus JPCs generierte iPSCs zu iMSCs differenziert, und ihre Eignung für Anwendungen im BTE anhand der osteogenen Differenzierung in vitro getestet. Neben der Verfügbarkeit von Stammzellen ist auch die Qualität des zur Verfügung stehenden Zellmaterials ein entscheidender Faktor. Die Gewinnung von Stammzellen aus Gewebebiopsien führt jedoch meistens zur Isolation von heterogenen Zellpopulationen aus verschiedenen Zelltypen, wodurch die Qualität sowie das Stammzellpotenzial der für das BTE benötigten Zellkulturen beeinträchtigt werden kann. Zur Qualitätskontrolle und zur Isolation osteogener Vorläuferzellen aus solchen Mischpopulationen werden Oberflächenmarker benötigt, mit denen sich osteogene Vorläuferzellen in heterogenen Zellpopulationen identifizieren und ggf. mithilfe von Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) isolieren lassen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Oberflächenmarker MSCA-1 (Mesenchymal Stromal Cell Antigen-1) und CD146 (Melanoma Cell Adhesion Molecule (MCAM)) auf ihre Eignung für die Separation osteogener Vorläuferzellen aus der Periostzelllinie TAg58 getestet. Dabei zeigte sich, dass obwohl beide Marker in der Literatur als osteogene Marker beschrieben waren, sich nur MSCA-1 zur Identifikation und Sortierung osteogener Vorläuferzellen in der verwendeten Zelllinie als geeignet erwies. Zur Herstellung von BTE-Produkten unter GMP-gerechten Bedingungen sollte bei der Zellkultur auf xenogene Bestandteile verzichtet werden. Daher wurde im Zuge dieser Arbeit die Kultivierung von JPCs von FBS- (fötales Kälberserum) auf hPL- (humanes Plättchenlysat) supplementiertes Medium umgestellt. Dabei zeigte sich, dass sich hPL wesentlich besser für die Kultivierung von JPCs eignete und Proliferation sowie Differenzierungspotenzial deutlich verbessert wurden. Zudem konnte für die osteogene Induktion von Periostzellen auf die Zugabe von Dexamethason unter hPL-Supplementierung verzichtet werden.