Sensitive Isotope Analysis of Micropollutants in Complex Sample Matrices

Abstract

In den letzten Jahrzehnten wurden zunehmend Berichte über die Kontamination von Gewässern durch Spurenschadstoffe veröffentlicht. Dabei stellen persistente und polare Spurenschadstoffe ein besonders großes Risiko dar, da sie in das Grundwasser sickern können und somit die Haupt-Trinkwasserquelle vieler europäischer Länder verunreinigen können. Aus diesem Grund ist es im Interesse der Umweltbehörden und der Forschung das Verhalten dieser Spurenschadstoffe in der Umwelt zu untersuchen. Herkömmliche Methoden zur Einschätzung des Umweltverhaltens basieren auf Konzentrationsmessungen eines Schadstoffes, sowie dessen Abbauprodukt. Wird ein Abbauprodukt allerdings nicht nur gebildet, sondern dieses ebenfalls weiter transformiert, können die Resultate über das Abbauverhalten der Muttersubstanz mehrdeutig sein. Neben dem weiteren Abbau des Metaboliten kann es durch unterschiedliche Mobilitäten des Metaboliten und des Ausgangsstoffes, sowie durch wiederholte Remobilisierungen aus dem Boden zu Fehleinschätzungen bezüglich des Abbaus kommen, was eine Risikobeurteilung erschwert. Eine alternative Herangehensweise zur Identifikation von Abbauprozessen ist die substanzspezifische Stabil-Isotopen-Analytik (compound-specific stable isotope analysis, CSIA). Bei dieser Methode wird die natürliche Verteilung der Isotopenhäufigkeit eines Elements (z.B. Kohlenstoff, Stickstoff) analysiert. Bisher war die substanzspezifische Stabil- Isotopen-Analytik allerdings auf die Analyse von Schadstoffen im unteren μg/l Konzentrationsbereich beschränkt. Daher war ein Ziel dieser Arbeit den Anwendungsbereich der substanzspezifischen Stabil-Isotopen-Analytik zu erweitern, um robuste Analysen für umweltrelevante Konzentrationen zu bewerkstelligen. Realisiert wurde dies durch die Entwicklung analytischer Methoden für polare Spurenschadstoffe in Umweltproben, sowie deren Anwendung auf systematische Feldstudien. Zudem wurden die Limitierungen der substanzspezifischen Stabil-Isotopen-Analytik im untern ng/l Konzentrationsbereich untersucht. Dafür wurden indikativ die häufig detektierten Spurenschadstoffe Desphenylchloridazon (DPC), 2,6-Dichlorbenzamid (BAM), Atrazin (ATZ) und Desethylatrazin (DEA) als Modellsubstanzen verwendet. Im zweiten Kapitel dieser Arbeit wurden Methoden zur Kohlen- und Stickstoffisotopenanalyse (δ13C und δ15N) polarer Spurenschadstoffe am Beispiel von DPC entwickelt. Zur Bestimmung der Kohlenstoffisotopenverhältnisse wurde Flüssigchromatographie mit einem Isotopenmassenspektrometer (LC-IRMS) gekoppelt, während für die Bestimmung der Stickstoffisotopenverhältnisse eine Methode mittels Derivatisierung und Gaschromatographie-Isotopenmassenspektrometrie entwickelt wurde. Beide Methoden zeigten reproduzierbare und akkurate δ13C und δ15N Isotopenwerte mit einer Präzisionsgrenze im μg/l Konzentrationsbereich. Dabei waren 996 ng an DPC auf der GC- Säule (on-column) ausreichend für die Kohlenstoffisotopenanalyse. Für die Stickstoffisotopenanalyse musste das DPC zunächst mit einem 160-fachen Überschuss an Trimethylsilyldiazomethan (TMSD) derivatisiert werden. Dabei wurde eine Präzisionsgrenze von 1200 ng DPC auf der GC-Säule bestimmt. Da Spurenschadstoffe in der Umwelt allerdings in einem geringeren Konzentrationsbereich vorkommen (ng/l bis μg/l), war eine Optimierung dieser Methode hinsichtlich ihrer Sensitivität notwendig. Durch die Probeninjektion direkt auf die GC-Säule (on-column Injektion) statt der bisherigen Splitless-Injektionstechnik, konnte für die Bestimmung der Stickstoffisotopenverhältnisse eine Präzisionsgrenze von 100 ng DPC auf der GC-Säule erreicht werden. Danach wurde die Eignung beider Methoden für die Messung von niedrig konzentrierten Umweltproben geprüft. Dafür wurden die Stickstoffisotopenverhältnisse von DPC in mit DPC kontaminiertem Sickerwasser analysiert. Zusätzlich wurde das Sickerwasser mit Chloridazon (CLZ) versetzt, welches sich nach und nach zu DPC abgebaut hat. Die Analyse der Stickstoffisotopenverhältnisse von DPC zeigte Unterschiede in den Isotopensignaturen, was die Differenzierung zwischen unterschiedlichen Eintragungsquellen des DPCs ermöglicht. Nachdem die Methoden zur CSIA polarer Spurenschadstoffe am Beispiel des DPCs in Kapitel 2 entwickelt worden war, wurde eine systematische Feldstudie zum Umweltverhalten des DPC und seiner Ausgangsverbindung CLZ in Lysimetern durchgeführt. Die in Kapitel 3 beschriebene Studie lieferte neue Erkenntnisse über den Abbau von DPC. Dabei wurde der Aspekt der zeitgleichen Bildung und Transformation des Metaboliten betrachtet. Die Erkenntnisse wurden mithilfe zweier analytischer Ansätze ermittelt: der bereits etablierten Methode basierend auf den Konzentrationsverhältnissen von Metabolit zu Ausgangsstoff, und der seit kurzem verfügbaren Kohlenstoff- und Stickstoffisotopenanalytik. Es zeigte sich, dass: (i) DPC in allen Lysimetern mit einer signifikanten 13C und 15N Anreicherung von bis zu +4 ‰ bzw. +3 ‰ transformiert wurde und (ii) das gebildete DPC, welches noch nicht transformiert worden war, den gleichen Stickstoffisotopenwert wie sein Ausgangsstoff CLZ hatte. Nachdem es allerdings weiter abgebaut wurde, konnte eine signifikante Kohlenstoff- und Stickstoffisotopenfraktionierung beobachtet werden. Das Ausmaß der Isotopenfraktionierung wurde teilweise durch die Remobilisierung von nicht-transformiertem DPC abgeschwächt. II Zusammenfassung Zudem zeigte sich, dass das Ausmaß der Isotopenfraktionierung in Abhängigkeit von der Art der Anwendung des Herbizides und des Metaboliten variierte. Dies impliziert den Einfluss von Pflanzen und der präferentiellen Flüsse auf die Bildung und den Abbau von DPC. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass (iii) bei einer Transformation von DPC die Isotopensignatur als Indikator für den Abbau zuverlässiger war, als das Verhältnis von Metabolit zu Ausgangsverbindung. Daher diente CSIA als Indikator für die DPC- Transformation, vorausgesetzt, es findet keine gleichzeitige Bildung und Transformation von DPC statt. Sobald jedoch die DPC-Bildung dominierte, war der Nachweis des DPC-Abbaus durch CSIA nicht mehr eindeutig, da die Änderungen der Isotopenwerte durch den erneuten Eintrag von DPC verringert wurden. Dabei erreichten die Metabolit-zu-Ausgangsstoff- Verhältnisse ein Maximum und konnten somit den Nachweis für die DPC-Bildung erbringen. Das bedeutet, dass sich beide Methoden ergänzen, insbesondere, wenn nur ein teilweiser Abbau des Herbizids stattfindet, denn während das Metabolit-zu-Ausgangsstoff-Verhältnis Informationen über die Remobilisierung eines Analyten liefert, zeigt CSIA die Entwicklung des Abbaus einer Verbindung. Das vierte Kapitel dieser Arbeit befasst sich mit den Herausforderungen der CSIA polarer und persistenter Spurenschadstoffe im natürlichen System Grundwasser. Zur Identifikation und Bewertung der Herausforderungen wurde Grundwasser mit ATZ, DEA und BAM versetzt und die Modellsubstanzen aus großen Volumina extrahiert. Im Gegensatz zu den vorangegangenen Laborversuchen, bei denen die Analyten in Leitungswasser gelöst waren, führte die Extraktion der Substanzen aus dem Grundwasser zu kleinen und nicht reproduzierbaren Wiederfindungsraten. Als Grund für die unvollständige Wiederfindung der Analyten wird der Einfluss der Grundwassermatrix bei der Extraktion angenommen. So können organische Bestandteile des Grundwassers wie z.B. Humin- und Fulvinsäuren mit den Modellsubstanzen ATZ und DEA sogenannte Analyt-Fulvinsäure-Komplexe bilden. Diese Komplexe werden vor allem unter sauren pH-Bedingungen gebildet und das Einstellen eines niedrigen pH- Wertes war Teil dieser Methode. Neben den unvollständigen Wiederfindungsraten wurde bei der großvolumigen Probenanreicherung (Extraktion von bis zu 100 L pro Probe) eine starke Isotopenfraktionierung beobachtet. Die Fraktionierung entsteht durch den Einfluss der Matrix, welche ebenfalls bei der Festphasenextraktion angereichert wurde. Dabei beeinträchtigt die Isotopensignatur der organischen Bestandteile des Grundwassers die Isotopensignatur des Analyten und kann, falls nicht identifiziert, zu einer Fehleinschätzung in der Quantifizierung des Schadstoffabbaus führen. Die Prüfung der in diesem Kapitel vorgestellten Methode zeigt die Notwendigkeit einer kritischen Begutachtung und Identifikation von Fehlerquellen im Vorfeld von künftigen Methodenentwicklungen mit besonderem Augenmerk auch auf Matrixeffekte. Ziel zukünftiger Studien wird es sein, die in diesem Kapitel identifizierten Limitierungen der substanzspezifischen Stabil-Isotopen-Analytik durch die Weiterentwicklung und Optimierung von Methoden und Analysegeräten zu eliminieren.

Reports of the contamination of natural water bodies with micropollutants have increased in the last decades. Most importantly, persistent and polar micropollutants are of major concern as they may leach into groundwater, the main source of drinking water in many countries within the European Union. Consequently, for environmental authorities and researchers, it is important to investigate the environmental fate of such micropollutants. Conventional assessment approaches rely on changes in concentrations of the contaminant and its metabolite. This, however, is often inconclusive as the simultaneous formation and transformation of the metabolite, differences in the mobility between parent compound and metabolite, or repeated mobilization may lead to erroneous interpretations. Compound- specific stable isotope analysis (CSIA) is a complementary approach to identify transformation processes based on the analysis of natural isotope abundances of an element (e.g. carbon, nitrogen). As CSIA has so far been limited to the analysis of pollutants in the sub-μg/L range, this thesis aims to broaden the application of CSIA by developing analytical methods for polar micropollutants in environmental samples, applying these for systematic field studies and testing the limits of CSIA in concentrations in the low ng/L range. To this end, the frequently detected micropollutants desphenylchloridazon (DPC), 2,6- dichlorobenzamide (BAM), atrazine (ATZ) and desethylatrazine (DEA) were used as model compounds. In the second chapter of this thesis, methods for carbon- and nitrogen-isotope analysis (δ13C and δ15N) of polar micropollutants were developed using liquid chromatography-isotope-ratio mass spectrometry (LC-IRMS) and derivatization gas chromatography-IRMS (GC-IRMS). DPC was used as a representative compound for polar contaminants during method development. Both methods resulted in reproducible and accurate δ13C and δ15N analysis of DPC with a limit of precise isotope analysis in the μg/L concentration range. For carbon isotope analysis 996 ng of DPC on-column were sufficient. Nitrogen isotope analysis was achieved by derivatization of DPC with a 160-fold excess of (trimethylsilyl)diazomethane. To enable the application of CSIA to environmental samples, where micropollutants are present in a concentration range of ng/L to sub-μg/L, more sensitive methods were required. Thus, the nitrogen isotope analysis was optimized using on-column injection, which resulted in accurate δ15N analysis for amounts greater than 100 ng DPC on-column. The feasibility of both methods was proven by measuring the isotopic composition of DPC in DPC-containing environmental-seepage water spiked with chloridazon (CLZ). The analysis indicated that it is possible to distinguish DPC containing different isotopic signatures. After the feasibility of CSIA for polar micropollutants such as DPC was shown, a systematic field study of the DPC and its parent compound CLZ was carried out as detailed in Chapter 3. This study gave new insights into DPC degradation pinpointing the influence of simultaneous formation and transformation of the metabolite using two analytical approaches—the well- established metabolite-to-parent compound ratio and the recently available carbon and nitrogen CSIA. We found that (i) DPC was transformed in all lysimeters, showing a significant enrichment in 13C and 15N by approximately +4 ‰ and +3 ‰, respectively. (ii) Formed DPC, which had not been subject to further transformation yet, showed the same nitrogen isotope value as its precursor CLZ. As further transformation took place, significant carbon and nitrogen isotope fractionation was observed that was partially attenuated when mixing with freshly mobilized DPC from the vadose zone took place. The extent of isotope fractionation varied depending on the method of application of the parent herbicide and metabolite, implying the influence of plants, and the preferential flow on the formation and degradation of DPC. Additionally, we demonstrated that (iii) when DPC was further transformed, the isotopic signature, as an integrated signal of DPC degradation, was more reliable as an indicator of degradation than the metabolite-to-parent-compound ratio. Hence, this study enables the application of CSIA as an indication of DPC transformation, provided that there is no simultaneous formation and transformation of DPC. On the other hand, when DPC formation dominated and evidence from CSIA was not conclusive because changes in isotope values were reduced by the fresh input, metabolite-to-parent-ratios reached a maximum and could provide evidence of DPC formation. This leads to the conclusion that both methods are complementary, in particular when only partial degradation of the herbicide is occurring. While the metabolite-to-parent ratio provides information about the re-mobilization of a compound, CSIA shows the evolution of a compound’s degradation. In Chapter 4 of this thesis, challenges in CSIA of polar and persistent micropollutants in groundwater were identified and critically discussed by evaluating a large volume extraction method of up to 100 L groundwater using ATZ, DEA and BAM as model compounds in low ng/L concentration ranges. It was found that, in contrast to previous laboratory experiments, where tap water was used, extracts from environmental groundwater resulted in low and non- reproducible recoveries. Since groundwater contains organic matter such as humic and fulvic acids, and as acidification was part of the extraction procedure, it is assumed that the change in pH prior to solid-phase extraction (SPE) may favor the formation of analyte-fulvic acid complexes leading to the low recoveries observed. In addition to unsatisfactory recoveries, the extensive sample enrichment also resulted in an extensive isotope fractionation as the isotopic signature of the organic matter interfered with the carbon isotope ratio of the target analytes. Such an interference would lead to an overestimation in the quantification of degradation, if unidentified. Thus, it is essential for future analytical method developments to critically evaluate each method and to include the investigation about a possible influence of sample matrix on the analysis already in the pre-tests. As this study has shown the limitations of CSIA of polar micropollutants in complex sample matrices, future studies may use this as a starting point towards more sensitive isotope analysis by methodological and instrumental advances.